Velge riktig omvendt transkriptase

Avian myeloblastosis virus (AMV) revers transkriptase er en av de vanligste RT-ene som brukes i laboratoriet. 170kDa heterodimeren krever 6–10 mM Mg2 + eller Mn2 + for aktivitet, og reaksjoner inkluderer ofte natriumpyrofosfat og spermidin for å øke cDNA-produksjon i full lengde og redusere dannelsen av hårnålene under syntese (3). AMV RT er mindre følsom for inhibering av sterk RNA sekundær struktur enn Moloney murine leukemia virus (M-MLV) RT (4).

Optimal enzymaktivitet og maksimal cDNA-lengde forekommer ved 42-48 ° C, men reaksjonstemperaturen kan variere fra 25 ° C til 58 ° C (5). Den høyere reaksjonstemperaturen hjelper med å denaturere regioner med sterk RNA sekundær struktur, noe som kan føre til at RT-er stopper og begrenser cDNA-størrelse (6-7). Av denne grunn brukes AMV RT ofte til å reversere transkribere RNA med sterk sekundær struktur. Som andre RT-er, er AMV RT kompatibel med genspesifikke primere, oligo (dT) 15-primere eller tilfeldige heksamerer, selv om bruk av tilfeldige heksamerer krever en redusert reaksjonstemperatur på 37 ° C. Genspesifikke RT-primere med passende høye smeltetemperaturer anbefales når reaksjonstemperaturen overstiger 42 ° C.

Selv om høye reaksjonstemperaturer effektivt kan løse områder med sterke sekundære strukturer, er disse temperaturene skadelige for RNA-integritet. RNA er termolabilt og utsatt for metallkatalysert nedbrytning. Normalt forekommer hydrolyse med lav frekvens, men RNA-hydrolyse blir en bekymring under visse forhold (f.eks. Ikke-optimal pH, høye temperaturer, tilstedeværelsen av toverdige kationer). Dermed har cDNA-syntese – spesielt cDNA-syntese av lange RNA – fordeler av å ikke eksponere RNA for høyere reaksjonstemperaturer. For å minimere tiden RNA bruker ved høye temperaturer, inneholder cDNA-synteseprotokoller ved bruk av AMV og M-MLV RT ofte et innledende denatureringstrinn, hvor RNA og RT-primer kombineres, kort oppvarmes for å hjelpe denaturere enhver sekundær struktur og deretter raskt avkjølt på is for å opprettholde denaturerte tilstanden. RT, reaksjonsbuffer og dNTPer tilsettes, og reaksjonen inkuberes ved ønsket temperatur.

AMV RT har en egen RNase H-aktivitet, som nedbryter RNA-strengen til en RNA / DNA-hybrid og kan spalte RNA-malen hvis RT stopper under syntese (8). Dette reduserer totalt cDNA-utbytte og prosentandelen av cDNA i full lengde, noe som begrenser nytten av AMV RT for å reversere transkribere RNA lenger enn ~ 5 kb.

Typiske RT-PCR-forhold inkluderer bruk av opptil 5 ug total RNA eller opptil 100 ng polyA + mRNA, 20–30 enheter enzym og en 60-minutters inkubasjon ved 42 ° C. AMV RT er mer prosessiv enn M-MLV RT (5–6), så det kreves færre enheter for å generere samme mengde cDNA; 25 enheter AMV RT tilsvarer omtrent 200 enheter M-MLV RT. Før PCR må AMV inaktiveres fordi AMV RT, i likhet med M-MLV RT, kan hemme Taq DNA-polymerase (9). Enzymet kan inaktiveres ved oppvarming til 70–100 ° C, etterfulgt av en 5-minutters inkubasjon på is. Den omvendte transkripsjonsreaksjonen blir ofte fortynnet før PCR, eller volumet av cDNA tilsatt til PCR er begrenset fordi spermidin kan hemme PCR (10). Denne begrensningen kan påvirke muligheten til å oppdage RNA-er med lav overflod negativt.

AMV RT anbefales for ett-trinns og totrinns RT-PCR og RT-qPCR, revers transkripsjon av RNA < 5kb og primer-utvidelse, spesielt hvis mal-RNA har sterk sekundær struktur.