De juiste reverse transcriptase kiezen

Avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase is een van de meest voorkomende RTs die in het laboratorium worden gebruikt. Het heterodimeer van 170 kDa vereist 6-10 mM Mg2 + of Mn2 + voor activiteit, en reacties omvatten vaak natriumpyrofosfaat en spermidine om de cDNA-productie van volledige lengte te verhogen en de vorming van haarspelden tijdens synthese te verminderen (3). AMV RT is minder gevoelig voor remming door een sterke secundaire RNA-structuur dan Moloney murine leukemievirus (M-MLV) RT (4).

Optimale enzymactiviteit en maximale cDNA-lengte treden op bij 42-48 ° C, maar de reactietemperatuur kan variëren van 25 ° C tot 58 ° C (5). De hogere reactietemperatuur helpt regios met een sterke secundaire RNA-structuur te denatureren, waardoor RTs kunnen blokkeren en de cDNA-grootte kunnen beperken (6–7). Om deze reden wordt AMV RT vaak gebruikt om RNAs met een sterke secundaire structuur om te keren. Net als andere RTs is AMV RT compatibel met genspecifieke primers, oligo (dT) 15-primers of willekeurige hexameren, hoewel het gebruik van willekeurige hexameren een verlaagde reactietemperatuur van 37 ° C vereist. Genspecifieke RT-primers met geschikte hoge smelttemperaturen worden aanbevolen wanneer de reactietemperatuur hoger is dan 42 ° C.

Hoewel hoge reactietemperaturen effectief gebieden met sterke secundaire structuren kunnen oplossen, zijn deze temperaturen schadelijk voor de RNA-integriteit. RNA is thermolabiel en vatbaar voor door metaal gekatalyseerde afbraak. Normaal gesproken vindt hydrolyse plaats met een lage frequentie, maar RNA-hydrolyse wordt onder bepaalde omstandigheden een punt van zorg (bijv. Niet-optimale pH, hoge temperaturen, de aanwezigheid van tweewaardige kationen). De cDNA-synthese – in het bijzonder cDNA-synthese van lange RNAs – is dus gebaat bij het niet blootstellen van RNA aan hogere reactietemperaturen. Om de hoeveelheid tijd die RNA bij hoge temperaturen doorbrengt te minimaliseren, bevatten cDNA-syntheseprotocollen die AMV- en M-MLV-RTs gebruiken vaak een initiële denaturatiestap, waarbij de RNA- en RT-primer worden gecombineerd, kort verhit om een secundaire structuur te helpen denatureren en vervolgens snel afgekoeld op ijs om de gedenatureerde toestand te behouden. De RT, reactiebuffer en dNTPs worden toegevoegd en de reactie wordt bij de gewenste temperatuur geïncubeerd.

AMV RT heeft een intrinsieke RNase H-activiteit, die de RNA-streng van een RNA / DNA-hybride afbreekt en kan splitsen de RNA-sjabloon als de RT pauzeert tijdens de synthese (8). Dit verlaagt de totale cDNA-opbrengst en het percentage cDNA van volledige lengte, waardoor de bruikbaarheid van AMV RT om RNAs langer dan ~ 5kb reverse transcriberen.

Typische RT-PCR-omstandigheden omvatten het gebruik van maximaal 5 µg totaal RNA of tot 100 ng polyA + mRNA, 20-30 eenheden enzym en een incubatie van 60 minuten bij 42 ° C. AMV RT is meer procesmatig dan M-MLV RT (5-6), dus er zijn minder eenheden nodig om dezelfde hoeveelheid cDNA te genereren; 25 eenheden AMV RT komt overeen met ongeveer 200 eenheden M-MLV RT. Voorafgaand aan PCR moet AMV worden geïnactiveerd omdat AMV RT, net als M-MLV RT, Taq DNA-polymerase kan remmen (9). Het enzym kan worden geïnactiveerd door verwarming tot 70-100 ° C, gevolgd door een incubatie van 5 minuten op ijs. De reverse transcriptiereactie wordt vaak verdund voorafgaand aan PCR of het volume van cDNA dat aan de PCR wordt toegevoegd, is beperkt omdat spermidine PCR kan remmen (10). Deze beperking kan een negatieve invloed hebben op het vermogen om RNAs met een lage abondantie te detecteren.

AMV RT wordt aanbevolen voor eenstaps en tweestaps RT-PCR en RT-qPCR, reverse transcriptie van RNAs < 5kb en primerextensie, vooral als het template-RNA een sterke secundaire structuur heeft.