Scegliere la trascrittasi inversa corretta
La trascrittasi inversa del virus della mieloblastosi aviaria (AMV) è una delle RT più comuni utilizzate in laboratorio. Leterodimero da 170 kDa richiede 6–10 mM Mg2 + o Mn2 + per lattività, e le reazioni spesso includono pirofosfato di sodio e spermidina per aumentare la produzione di cDNA a tutta lunghezza e diminuire la formazione di forcine durante la sintesi (3). LAMV RT è meno sensibile allinibizione da parte di una forte struttura secondaria dellRNA rispetto al virus della leucemia murina di Moloney (M-MLV) RT (4).
Lattività enzimatica ottimale e la lunghezza massima del cDNA si verificano a 42-48 ° C, ma la temperatura di reazione può variare da 25 ° C a 58 ° C (5). La temperatura di reazione più alta aiuta a denaturare le regioni di forte struttura secondaria di RNA, che può causare lo stallo degli RT e limitare la dimensione del cDNA (6–7). Per questo motivo, AMV RT viene spesso utilizzato per la trascrizione inversa di RNA con una forte struttura secondaria. Come altri RT, AMV RT è compatibile con primer gene-specifici, primer oligo (dT) 15 o esameri casuali, sebbene luso di esameri casuali richieda una temperatura di reazione ridotta di 37 ° C. I primer RT genico-specifici con temperature di fusione adeguatamente elevate sono raccomandati quando la temperatura di reazione supera i 42 ° C.
Sebbene le alte temperature di reazione possano risolvere efficacemente regioni di forti strutture secondarie, queste temperature sono dannose per lintegrità dellRNA. LRNA è termolabile e suscettibile alla degradazione catalizzata da metalli. Normalmente, lidrolisi si verifica a bassa frequenza, ma lidrolisi dellRNA diventa un problema in determinate condizioni (ad es. PH non ottimale, alte temperature, presenza di cationi bivalenti). Pertanto, la sintesi del cDNA, in particolare la sintesi del cDNA di RNA lunghi, trae vantaggio dal non esporre lRNA a temperature di reazione più elevate. Per ridurre al minimo la quantità di tempo che lRNA trascorre ad alte temperature, i protocolli di sintesi del cDNA che utilizzano RT AMV e M-MLV spesso incorporano una fase di denaturazione iniziale, in cui lRNA e il primer RT vengono combinati, riscaldati brevemente per aiutare a denaturare qualsiasi struttura secondaria e poi raffreddati rapidamente sul ghiaccio per mantenere lo stato denaturato. La RT, il tampone di reazione e i dNTP vengono aggiunti e la reazione viene incubata alla temperatura desiderata.
AMV RT possiede unattività intrinseca di RNasi H, che degrada il filamento di RNA di un ibrido RNA / DNA e può fendere lo stampo di RNA se la RT si ferma durante la sintesi (8). Ciò riduce la resa totale di cDNA e la percentuale di cDNA a lunghezza intera, limitando lutilità di AMV RT per la trascrizione inversa di RNA più lunghi di ~ 5kb.
Le condizioni tipiche di RT-PCR includono luso fino a 5 µg di totale RNA o fino a 100 ng di polyA + mRNA, 20-30 unità di enzima e incubazione di 60 minuti a 42 ° C. AMV RT è più processivo di M-MLV RT (5–6), quindi sono necessarie meno unità per generare la stessa quantità di cDNA; 25 unità di AMV RT equivalgono a circa 200 unità di M-MLV RT. Prima della PCR, lAMV deve essere inattivato perché lAMV RT, come lM-MLV RT, può inibire la Taq DNA polimerasi (9). Lenzima può essere inattivato mediante riscaldamento a 70–100 ° C, seguito da unincubazione di 5 minuti in ghiaccio. La reazione di trascrizione inversa viene spesso diluita prima della PCR o il volume di cDNA aggiunto alla PCR è limitato perché la spermidina può inibire la PCR (10). Questa limitazione può influire negativamente sulla capacità di rilevare RNA a bassa abbondanza.
AMV RT è raccomandato per RT-PCR e RT-qPCR in una o due fasi, trascrizione inversa di RNA < 5kb e estensione del primer, in particolare se lRNA del modello ha una forte struttura secondaria.