Choisir la bonne transcriptase inverse
La transcriptase inverse du virus de la myéloblastose aviaire (AMV) est l’une des RT les plus couramment utilisées en laboratoire. Lhétérodimère de 170 kDa nécessite 6 à 10 mM de Mg2 + ou Mn2 + pour son activité, et les réactions incluent souvent du pyrophosphate de sodium et de la spermidine pour augmenter la production dADNc sur toute la longueur et réduire la formation dépingles à cheveux pendant la synthèse (3). LAMV RT est moins sensible à linhibition par une forte structure secondaire dARN que le virus de la leucémie murine de Moloney (M-MLV) RT (4).
Lactivité enzymatique optimale et la longueur maximale de lADNc se produisent à 42–48 ° C, la température de réaction peut aller de 25 ° C à 58 ° C (5). La température de réaction plus élevée aide à dénaturer les régions de forte structure secondaire dARN, ce qui peut provoquer le blocage des RT et limiter la taille de lADNc (6-7). Pour cette raison, AMV RT est souvent utilisé pour inverser la transcription des ARN à forte structure secondaire. Comme les autres RT, AMV RT est compatible avec les amorces spécifiques du gène, les amorces oligo (dT) 15 ou les hexamères aléatoires, bien que lutilisation dhexamères aléatoires nécessite une température de réaction réduite de 37 ° C. Les amorces RT spécifiques au gène avec des températures de fusion suffisamment élevées sont recommandées lorsque la température de réaction dépasse 42 ° C.
Bien que des températures de réaction élevées puissent efficacement résoudre les régions de structures secondaires fortes, ces températures sont préjudiciables à lintégrité de lARN. LARN est thermolabile et sensible à la dégradation catalysée par les métaux. Normalement, lhydrolyse se produit à une faible fréquence, mais lhydrolyse de lARN devient un problème dans certaines conditions (par exemple, pH non optimal, températures élevées, présence de cations divalents). Ainsi, la synthèse dADNc – en particulier la synthèse dADNc dARN longs – bénéficie du fait de ne pas exposer lARN à des températures de réaction plus élevées. Pour minimiser le temps que lARN passe à des températures élevées, les protocoles de synthèse dADNc utilisant les RT AMV et M-MLV intègrent souvent une étape de dénaturation initiale, où lamorce ARN et RT sont combinées, brièvement chauffées pour aider à dénaturer toute structure secondaire puis rapidement refroidie sur glace pour maintenir létat dénaturé. Le RT, le tampon de réaction et les dNTP sont ajoutés, et la réaction est incubée à la température désirée.
AMV RT possède une activité RNase H intrinsèque, qui dégrade le brin dARN dun hybride ARN / ADN et peut cliver le modèle dARN si le RT sarrête pendant la synthèse (8). Cela réduit le rendement total dADNc et le pourcentage dADNc de pleine longueur, limitant lutilité de lAMV RT pour inverser la transcription des ARN de plus de ~ 5 kb.
Les conditions typiques de RT-PCR incluent lutilisation de jusquà 5 µg du total ARN ou jusquà 100 ng dARNm polyA +, 20 à 30 unités denzyme et une incubation de 60 minutes à 42 ° C. AMV RT est plus processif que M-MLV RT (5–6), donc moins dunités sont nécessaires pour générer la même quantité dADNc; 25 unités dAMV RT équivalent à environ 200 unités de M-MLV RT. Avant la PCR, lAMV doit être inactivé car lAMV RT, comme le M-MLV RT, peut inhiber lADN polymérase Taq (9). Lenzyme peut être inactivée par chauffage à 70-100 ° C, suivi dune incubation de 5 minutes sur de la glace. La réaction de transcription inverse est souvent diluée avant la PCR ou le volume dADNc ajouté à la PCR est limité car la spermidine peut inhiber la PCR (10). Cette limitation peut affecter négativement la capacité à détecter les ARN de faible abondance.
AMV RT est recommandé pour la RT-PCR et RT-qPCR en une et deux étapes, la transcription inverse des ARN < 5 Ko et extension damorce, en particulier si lARN modèle a une structure secondaire forte.