Auswahl der richtigen reversen Transkriptase
Die reverse Transkriptase des Vogel-Myeloblastose-Virus (AMV) ist eine der häufigsten im Labor verwendeten RTs. Das 170 kDa-Heterodimer benötigt 6–10 mM Mg2 + oder Mn2 + für die Aktivität. Zu den Reaktionen gehören häufig Natriumpyrophosphat und Spermidin, um die cDNA-Produktion in voller Länge zu erhöhen und die Bildung von Haarnadeln während der Synthese zu verringern (3). AMV RT reagiert weniger empfindlich auf die Hemmung durch eine starke RNA-Sekundärstruktur als das Moloney-Mausleukämievirus (M-MLV) RT (4).
Optimale Enzymaktivität und maximale cDNA-Länge treten jedoch bei 42–48 ° C auf Die Reaktionstemperatur kann zwischen 25 ° C und 58 ° C liegen (5). Die höhere Reaktionstemperatur hilft dabei, Regionen mit starker RNA-Sekundärstruktur zu denaturieren, was dazu führen kann, dass RTs blockieren und die cDNA-Größe begrenzen (6–7). Aus diesem Grund wird AMV RT häufig verwendet, um transkribierte RNAs mit starker Sekundärstruktur umzukehren. Wie andere RTs ist AMV RT mit genspezifischen Primern, Oligo (dT) 15-Primern oder zufälligen Hexameren kompatibel, obwohl die Verwendung von zufälligen Hexameren eine reduzierte Reaktionstemperatur von 37 ° C erfordert. Genspezifische RT-Primer mit entsprechend hohen Schmelztemperaturen werden empfohlen, wenn die Reaktionstemperatur 42 ° C überschreitet.
Obwohl hohe Reaktionstemperaturen Regionen mit starken Sekundärstrukturen effektiv auflösen können, sind diese Temperaturen für die RNA-Integrität schädlich. RNA ist thermolabil und anfällig für metallkatalysierten Abbau. Normalerweise tritt die Hydrolyse mit einer niedrigen Frequenz auf, aber die RNA-Hydrolyse wird unter bestimmten Bedingungen (z. B. nicht optimaler pH-Wert, hohe Temperaturen, Vorhandensein zweiwertiger Kationen) zu einem Problem. Daher profitiert die cDNA-Synthese – insbesondere die cDNA-Synthese langer RNAs – davon, dass RNA keinen höheren Reaktionstemperaturen ausgesetzt wird. Um die Zeit zu minimieren, die RNA bei hohen Temperaturen verbringt, beinhalten cDNA-Syntheseprotokolle unter Verwendung von AMV- und M-MLV-RTs häufig einen anfänglichen Denaturierungsschritt, bei dem der RNA- und RT-Primer kombiniert und kurz erwärmt wird, um die Denaturierung einer Sekundärstruktur zu unterstützen, und dann schnell abgekühlt wird auf Eis, um den denaturierten Zustand aufrechtzuerhalten. Die RT, der Reaktionspuffer und die dNTPs werden zugegeben und die Reaktion wird bei der gewünschten Temperatur inkubiert. AMV RT besitzt eine intrinsische RNase H-Aktivität, die den RNA-Strang eines RNA / DNA-Hybrids abbaut und spalten kann die RNA-Matrize, wenn die RT während der Synthese pausiert (8). Dies verringert die Gesamt-cDNA-Ausbeute und den Prozentsatz der cDNA voller Länge, wodurch die Nützlichkeit von AMV RT zur Reverse-Transkription von RNAs, die länger als ~ 5 kb sind, begrenzt wird. Typische RT-PCR-Bedingungen umfassen die Verwendung von bis zu 5 & mgr; g Gesamtmenge RNA oder bis zu 100 ng PolyA + mRNA, 20–30 Einheiten Enzym und eine 60-minütige Inkubation bei 42 ° C. AMV RT ist prozessiver als M-MLV RT (5–6), sodass weniger Einheiten erforderlich sind, um die gleiche Menge an cDNA zu erzeugen. 25 Einheiten AMV RT entsprechen ungefähr 200 Einheiten M-MLV RT. Vor der PCR muss AMV inaktiviert werden, da AMV RT wie M-MLV RT die Taq-DNA-Polymerase hemmen kann (9). Das Enzym kann durch Erhitzen auf 70–100 ° C und anschließende 5-minütige Inkubation auf Eis inaktiviert werden. Die reverse Transkriptionsreaktion wird häufig vor der PCR verdünnt oder das Volumen der der PCR zugesetzten cDNA ist begrenzt, da Spermidin die PCR hemmen kann (10). Diese Einschränkung kann die Fähigkeit zum Nachweis von RNAs mit geringer Häufigkeit negativ beeinflussen.
AMV RT wird für einstufige und zweistufige RT-PCR und RT-qPCR empfohlen, reverse Transkription von RNAs < 5 kb und Primerverlängerung, insbesondere wenn die Matrizen-RNA eine starke Sekundärstruktur aufweist.