Elección de la transcriptasa inversa correcta
La transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV) es una de las RT más comunes utilizadas en el laboratorio. El heterodímero de 170 kDa requiere 6-10 mM de Mg2 + o Mn2 + para su actividad, y las reacciones a menudo incluyen pirofosfato de sodio y espermidina para aumentar la producción de ADNc de longitud completa y disminuir la formación de horquillas durante la síntesis (3). La RT de AMV es menos sensible a la inhibición por una estructura secundaria de ARN fuerte que la RT del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) (4).
La actividad enzimática óptima y la longitud máxima del ADNc ocurren a 42-48 ° C, pero la temperatura de reacción puede oscilar entre 25 ° C y 58 ° C (5). La temperatura de reacción más alta ayuda a desnaturalizar las regiones de estructura secundaria de ARN fuerte, lo que puede hacer que los RT se detengan y limiten el tamaño del ADNc (6-7). Por esta razón, AMV RT se usa a menudo para realizar la transcripción inversa de ARN con una estructura secundaria fuerte. Al igual que otros RT, AMV RT es compatible con cebadores de genes específicos, cebadores oligo (dT) 15 o hexámeros aleatorios, aunque el uso de hexámeros aleatorios requiere una temperatura de reacción reducida de 37 ° C. Se recomiendan cebadores de RT específicos de genes con temperaturas de fusión adecuadamente altas cuando la temperatura de reacción supera los 42 ° C.
Aunque las altas temperaturas de reacción pueden resolver eficazmente regiones de estructuras secundarias fuertes, estas temperaturas son perjudiciales para la integridad del ARN. El ARN es termolábil y susceptible a la degradación catalizada por metales. Normalmente, la hidrólisis se produce con una frecuencia baja, pero la hidrólisis del ARN se convierte en un problema en determinadas condiciones (p. Ej., PH no óptimo, altas temperaturas, presencia de cationes divalentes). Por tanto, la síntesis de cDNA, en particular la síntesis de cDNA de RNA largos, se beneficia de no exponer el RNA a temperaturas de reacción más altas. Para minimizar la cantidad de tiempo que el ARN pasa a altas temperaturas, los protocolos de síntesis de ADNc que utilizan AMV y M-MLV RT a menudo incorporan un paso de desnaturalización inicial, donde el cebador de ARN y RT se combinan, se calientan brevemente para ayudar a desnaturalizar cualquier estructura secundaria y luego se enfrían rápidamente en hielo para mantener el estado desnaturalizado. Se añaden la RT, el tampón de reacción y los dNTP, y la reacción se incuba a la temperatura deseada.
La RT de AMV posee una actividad ARNasa H intrínseca, que degrada la hebra de ARN de un híbrido de ARN / ADN y puede escindirse la plantilla de ARN si el RT se detiene durante la síntesis (8). Esto reduce el rendimiento de cDNA total y el porcentaje de cDNA de longitud completa, lo que limita la utilidad de AMV RT para realizar la transcripción inversa de ARN de más de ~ 5 kb.
Las condiciones típicas de RT-PCR incluyen el uso de hasta 5 µg de total ARN o hasta 100 ng de poliA + ARNm, 20-30 unidades de enzima y una incubación de 60 minutos a 42 ° C. AMV RT es más procesado que M-MLV RT (5-6), por lo que se requieren menos unidades para generar la misma cantidad de ADNc; 25 unidades de AMV RT equivalen aproximadamente a 200 unidades de M-MLV RT. Antes de la PCR, AMV debe inactivarse porque AMV RT, como M-MLV RT, puede inhibir la ADN polimerasa Taq (9). La enzima puede inactivarse calentando a 70–100 ° C, seguido de una incubación de 5 minutos en hielo. La reacción de transcripción inversa a menudo se diluye antes de la PCR o el volumen de ADNc agregado a la PCR es limitado porque la espermidina puede inhibir la PCR (10). Esta limitación puede afectar negativamente la capacidad de detectar ARN de baja abundancia.
Se recomienda la RT de AMV para RT-PCR y RT-qPCR de uno y dos pasos, transcripción inversa de ARN < 5 kb y extensión del cebador, especialmente si el ARN molde tiene una estructura secundaria fuerte.