Valg af den rigtige omvendte transkriptase

Fuglemyeloblastose-virus (AMV) revers transkriptase er en af de mest almindelige RTer, der anvendes i laboratoriet. 170kDa heterodimeren kræver 6–10 mM Mg2 + eller Mn2 + til aktivitet, og reaktioner inkluderer ofte natriumpyrophosphat og spermidin for at øge cDNA-produktion i fuld længde og mindske dannelsen af hårnåle under syntese (3). AMV RT er mindre følsom over for inhibering af stærk RNA sekundær struktur end Moloney murine leukæmivirus (M-MLV) RT (4).

Optimal enzymaktivitet og maksimal cDNA-længde forekommer ved 42-48 ° C, men reaktionstemperaturen kan variere fra 25 ° C til 58 ° C (5). Den højere reaktionstemperatur hjælper med at denaturere regioner med stærk sekundær RNA-struktur, hvilket kan få RTer til at stoppe og begrænse cDNA-størrelse (6-7). Af denne grund bruges AMV RT ofte til at reversere transkribere RNAer med stærk sekundær struktur. Ligesom andre RTer er AMV RT kompatibel med genspecifikke primere, oligo (dT) 15-primere eller tilfældige hexamerer, skønt anvendelse af tilfældige hexamerer kræver en reduceret reaktionstemperatur på 37 ° C. Genspecifikke RT-primere med passende høje smeltetemperaturer anbefales, når reaktionstemperaturen overstiger 42 ° C.

Selvom høje reaktionstemperaturer effektivt kan løse regioner med stærke sekundære strukturer, er disse temperaturer skadelige for RNA-integritet. RNA er termolabilt og modtageligt for metal-katalyseret nedbrydning. Normalt forekommer hydrolyse ved en lav frekvens, men RNA-hydrolyse bliver en bekymring under visse betingelser (fx ikke-optimal pH, høje temperaturer, tilstedeværelsen af divalente kationer). Således har cDNA-syntese – især cDNA-syntese af lange RNAer – fordel ved ikke at udsætte RNA for højere reaktionstemperaturer. For at minimere den tid, som RNA bruger ved høje temperaturer, indeholder cDNA-synteseprotokoller, der bruger AMV og M-MLV RTer, ofte et indledende denatureringstrin, hvor RNA og RT-primeren kombineres, opvarmes kortvarigt for at hjælpe med at denaturere enhver sekundær struktur og derefter hurtigt afkøles på is for at opretholde den denaturerede tilstand. RT, reaktionsbuffer og dNTPer tilsættes, og reaktionen inkuberes ved den ønskede temperatur.

AMV RT har en iboende RNase H-aktivitet, der nedbryder RNA-strengen i en RNA / DNA-hybrid og kan spalte RNA-skabelonen, hvis RT holder pause under syntese (8). Dette reducerer det samlede cDNA-udbytte og procentdelen af cDNA i fuld længde, hvilket begrænser anvendeligheden af AMV RT til revers transkribering af RNAer, der er længere end ~ 5 kb.

Typiske RT-PCR-betingelser inkluderer anvendelsen af op til 5 µg af total RNA eller op til 100 ng polyA + mRNA, 20-30 enheder enzym og en 60-minutters inkubation ved 42 ° C. AMV RT er mere processiv end M-MLV RT (5-6), så der kræves færre enheder for at generere den samme mængde cDNA; 25 enheder AMV RT svarer til ca. 200 enheder M-MLV RT. Før PCR skal AMV inaktiveres, fordi AMV RT, ligesom M-MLV RT, kan hæmme Taq DNA-polymerase (9). Enzymet kan inaktiveres ved opvarmning til 70-100 ° C efterfulgt af en 5-minutters inkubation på is. Den omvendte transkriptionsreaktion fortyndes ofte før PCR, eller volumenet af cDNA tilsat til PCR er begrænset, fordi spermidin kan hæmme PCR (10). Denne begrænsning kan påvirke evnen til at detektere RNAer med lav overflod negativt.

AMV RT anbefales til et-trins og totrins RT-PCR og RT-qPCR, omvendt transkription af RNAer < 5kb og primer-udvidelse, især hvis skabelon-RNAet har en stærk sekundær struktur.