Att välja rätt omvänd transkriptas

Avian myeloblastosis virus (AMV) omvänd transkriptas är en av de vanligaste RT: erna som används i laboratoriet. 170kDa heterodimeren kräver 6–10 mM Mg2 + eller Mn2 + för aktivitet, och reaktionerna inkluderar ofta natriumpyrofosfat och spermidin för att öka cDNA-produktion i full längd och minska bildandet av hårnålar under syntes (3). AMV RT är mindre känslig för inhibering av stark sekundär RNA-struktur än Moloney murint leukemivirus (M-MLV) RT (4).

Optimal enzymaktivitet och maximal cDNA-längd förekommer vid 42–48 ° C, men reaktionstemperaturen kan variera från 25 ° C till 58 ° C (5). Den högre reaktionstemperaturen hjälper till att denaturera regioner med stark sekundär RNA-struktur, vilket kan få RT att stanna och begränsa cDNA-storlek (6-7). Av denna anledning används AMV RT ofta för att reversera transkribera RNA med stark sekundär struktur. Liksom andra RT: er är AMV RT kompatibel med genspecifika primers, oligo (dT) 15-primers eller slumpmässiga hexamerer, även om användning av slumpmässiga hexamerer kräver en reducerad reaktionstemperatur på 37 ° C. Genspecifika RT-primers med lämpligt höga smälttemperaturer rekommenderas när reaktionstemperaturen överstiger 42 ° C.

Även om höga reaktionstemperaturer effektivt kan lösa regioner med starka sekundära strukturer är dessa temperaturer skadliga för RNA-integritet. RNA är termolabilt och mottagligt för metallkatalyserad nedbrytning. Normalt sker hydrolys vid låg frekvens, men RNA-hydrolys blir ett problem under vissa förhållanden (t.ex. icke-optimalt pH, höga temperaturer, närvaron av tvåvärda katjoner). Således drar cDNA-syntes – i synnerhet cDNA-syntes av långa RNA – fördel av att inte utsätta RNA för högre reaktionstemperaturer. För att minimera den tid som RNA spenderar vid höga temperaturer, innehåller cDNA-syntesprotokoll med AMV och M-MLV RT: er ofta ett första denatureringssteg, där RNA och RT-primer kombineras, värms kort för att hjälpa till att denaturera eventuell sekundär struktur och sedan snabbt kylas på is för att bibehålla det denaturerade tillståndet. RT, reaktionsbuffert och dNTP tillsätts och reaktionen inkuberas vid önskad temperatur.

AMV RT har en inneboende RNas H-aktivitet, som bryter ner RNA-strängen i en RNA / DNA-hybrid och kan klyva RNA-mallen om RT pausar under syntesen (8). Detta minskar det totala cDNA-utbytet och andelen cDNA i full längd, vilket begränsar användningen av AMV RT för att omvänd transkribera RNA längre än ~ 5 kb.

Typiska RT-PCR-förhållanden inkluderar användning av upp till 5 µg totalt RNA eller upp till 100 ng polyA + mRNA, 20–30 enheter enzym och en 60-minuters inkubation vid 42 ° C. AMV RT är mer processivt än M-MLV RT (5–6), så färre enheter krävs för att generera samma mängd cDNA; 25 enheter AMV RT motsvarar cirka 200 enheter M-MLV RT. Före PCR måste AMV inaktiveras eftersom AMV RT, som M-MLV RT, kan hämma Taq DNA-polymeras (9). Enzymet kan inaktiveras genom upphettning vid 70–100 ° C, följt av en 5-minuters inkubation på is. Den omvända transkriptionsreaktionen späds ofta före PCR eller så är volymen cDNA som tillsätts till PCR begränsad eftersom spermidin kan hämma PCR (10). Denna begränsning kan negativt påverka förmågan att detektera RNA med låg överflöd.

AMV RT rekommenderas för enstegs- och tvåstegs RT-PCR och RT-qPCR, omvänd transkription av RNA < 5kb och primerförlängning, särskilt om mallen RNA har stark sekundär struktur.