Oikean käänteistranskriptaasin valitseminen

Lintujen myeloblastoosiviruksen (AMV) käänteistranskriptaasi on yksi yleisimmistä laboratoriossa käytetyistä RT: stä. 170 kDa: n heterodimeeri vaatii aktiivisuudeksi 6–10 mM Mg2 + tai Mn2 +, ja reaktiot sisältävät usein natriumpyrofosfaattia ja spermidiiniä täyspitkän cDNA-tuotannon lisäämiseksi ja hiusneulojen muodostumisen vähentämiseksi synteesin aikana (3). AMV RT on vähemmän herkkä vahvan RNA-sekundaarirakenteen aiheuttamalle estämiselle kuin Moloney-hiiren leukemiavirus (M-MLV) RT (4).

Optimaalinen entsyymiaktiivisuus ja suurin cDNA-pituus esiintyvät 42–48 ° C: ssa, mutta reaktiolämpötila voi vaihdella välillä 25 ° C – 58 ° C (5). Korkeampi reaktiolämpötila auttaa denaturoimaan vahvan RNA: n sekundaarirakenteen alueita, mikä voi aiheuttaa RT: n pysähtymisen ja rajoittaa cDNA: n kokoa (6–7). Tästä syystä AMV RT: tä käytetään usein voimakkaasti toissijaisen rakenteen omaavien RNA: iden transkriptoimiseksi. Kuten muutkin RT: t, AMV RT on yhteensopiva geenispesifisten alukkeiden, oligo (dT) 15 -alukkeiden tai satunnaisheksameerien kanssa, vaikka satunnaisten heksameerien käyttö vaatii alennettua reaktiolämpötilaa 37 ° C. Geenispesifisiä RT-alukkeita, joilla on sopivasti korkeat sulamislämpötilat, suositellaan, kun reaktiolämpötila ylittää 42 ° C.

Vaikka korkeat reaktiolämpötilat voivat tehokkaasti ratkaista vahvojen sekundaarirakenteiden alueet, nämä lämpötilat vahingoittavat RNA: n eheyttä. RNA on termolabiili ja altis metallikatalysoidulle hajoamiselle. Normaalisti hydrolyysi tapahtuu matalalla taajuudella, mutta RNA: n hydrolyysistä tulee huolta tietyissä olosuhteissa (esim. Ei-optimaalinen pH, korkeat lämpötilat, kaksiarvoisten kationien läsnäolo). Siten cDNA-synteesi – erityisesti pitkien RNA: iden cDNA-synteesi – hyötyy siitä, että RNA: ta ei altisteta korkeammille reaktiolämpötiloille. RNA: n korkeissa lämpötiloissa viettämän ajan minimoimiseksi cDNA-synteesiprotokollat, joissa käytetään AMV- ja M-MLV-RT: itä, sisältävät usein alkuperäisen denaturointivaiheen, jossa RNA ja RT-aluke yhdistetään, kuumennetaan hetkellisesti minkä tahansa sekundäärirakenteen denaturoimiseksi ja sitten jäähdytetään nopeasti jäällä denaturoidun tilan ylläpitämiseksi. RT, reaktiopuskuri ja dNTP lisätään ja reaktiota inkuboidaan halutussa lämpötilassa.

AMV RT: llä on luonnostaan RNaasi H -aktiivisuus, joka hajottaa RNA / DNA-hybridin RNA-juosteen ja voi pilkkoutua. RNA-templaatti, jos RT pysähtyy synteesin aikana (8). Tämä vähentää cDNA: n kokonaissaantoa ja täyspitkän cDNA: n prosenttiosuutta ja rajoittaa AMV RT: n käyttökelpoisuutta kääntää yli 5 kb: n pituisten transkriptio-RNA: iden kääntäminen.

Tyypillisiin RT-PCR-olosuhteisiin sisältyy enintään 5 ug: n käyttö RNA tai enintään 100 ng polyA + mRNA: ta, 20–30 yksikköä entsyymiä ja 60 minuutin inkubointi 42 ° C: ssa. AMV RT on prosessivisempi kuin M-MLV RT (5–6), joten saman yksikön cDNA: n muodostamiseen tarvitaan vähemmän yksiköitä; 25 yksikköä AMV RT: tä vastaa noin 200 yksikköä M-MLV RT: tä. Ennen PCR: ää AMV on inaktivoitava, koska AMV RT, kuten M-MLV RT, voi estää Taq-DNA-polymeraasia (9). Entsyymi voidaan inaktivoida kuumentamalla 70–100 ° C: ssa, mitä seuraa 5 minuutin inkubointi jäillä. Käänteiskopiointireaktio laimennetaan usein ennen PCR: ää tai PCR: ään lisätyn cDNA: n tilavuus on rajoitettu, koska spermidiini voi estää PCR: ää (10). Tämä rajoitus voi vaikuttaa negatiivisesti kykyyn havaita matalan runsauden RNA: ita.

AMV RT: tä suositellaan yksivaiheiselle ja kaksivaiheiselle RT-PCR: lle ja RT-qPCR: lle, RNA: iden käänteiskopiointi < 5 kb: n ja alukkeen jatke, varsinkin jos templaatti-RNA: lla on vahva toissijainen rakenne.