Alegerea transcriptazei reversibile potrivite

Transcriptaza inversă a virusului mieloblastozei aviare (AMV) este una dintre cele mai frecvente RT utilizate în laborator. Heterodimerul de 170kDa necesită 6-10 mM Mg2 + sau Mn2 + pentru activitate, iar reacțiile includ adesea pirofosfat de sodiu și spermidină pentru a crește producția de ADNc pe toată lungimea și pentru a scădea formarea acelor de păr în timpul sintezei (3). RT AMV este mai puțin sensibil la inhibarea de către o structură secundară ARN puternică decât virusul leucemiei murinice Moloney (M-MLV) RT (4).

Activitatea enzimatică optimă și lungimea maximă a ADNc apar la 42-48 ° C, dar temperatura de reacție poate varia de la 25 ° C la 58 ° C (5). Temperatura de reacție mai mare ajută la denaturarea regiunilor structurii secundare puternice a ARN-ului, ceea ce poate determina blocarea RT și limitarea dimensiunii ADNc (6-7). Din acest motiv, AMV RT este adesea utilizat pentru a inversa transcrierea ARN-urilor cu structură secundară puternică. La fel ca alte RT, AMV RT este compatibil cu primeri specifici genei, primeri oligo (dT) 15 sau hexameri aleatori, deși utilizarea hexamerilor aleatori necesită o temperatură de reacție redusă de 37 ° C. Primerii RT genici cu temperaturi de topire adecvate sunt recomandate atunci când temperatura de reacție depășește 42 ° C.

Deși temperaturile de reacție ridicate pot rezolva în mod eficient regiunile structurilor secundare puternice, aceste temperaturi sunt dăunătoare integrității ARN-ului. ARN este termolabil și susceptibil la degradarea catalizată de metale. În mod normal, hidroliza are loc la o frecvență scăzută, dar hidroliza ARN devine o preocupare în anumite condiții (de exemplu, pH neoptim, temperaturi ridicate, prezența cationilor divalenți). Astfel, sinteza ADNc – în special sinteza ADNc a ARN-urilor lungi – beneficiază de faptul că nu expune ARN la temperaturi mai mari de reacție. Pentru a minimiza timpul petrecut de ARN la temperaturi ridicate, protocoalele de sinteză ale ADNc care utilizează RT AMV și M-MLV încorporează adesea o etapă inițială de denaturare, în care primerul ARN și RT sunt combinate, încălzite scurt pentru a ajuta la denaturarea oricărei structuri secundare apoi răcite rapid pe gheață pentru a menține starea denaturată. Se adaugă RT, tampon de reacție și dNTP-uri, iar reacția este incubată la temperatura dorită.

AMV RT posedă o activitate RNază H intrinsecă, care degradează catena de ARN a unui hibrid ARN / ADN și poate cliva șablonul ARN dacă RT face o pauză în timpul sintezei (8). Acest lucru reduce randamentul total de ADNc și procentul de ADNc de lungime completă, limitând utilitatea AMV RT pentru transcrierea inversă a ARN-urilor mai lungi de ~ 5kb.

Condițiile tipice de RT-PCR includ utilizarea a până la 5µg din total ARN sau până la 100 ng de poliA + mARN, 20-30 unități de enzimă și o incubație de 60 de minute la 42 ° C. AMV RT este mai procesiv decât M-MLV RT (5-6), deci sunt necesare mai puține unități pentru a genera aceeași cantitate de ADNc; 25 de unități de AMV RT sunt echivalente cu aproximativ 200 de unități de M-MLV RT. Înainte de PCR, AMV trebuie inactivat deoarece AMV RT, la fel ca M-MLV RT, poate inhiba Taq ADN polimeraza (9). Enzima poate fi inactivată prin încălzire la 70-100 ° C, urmată de o incubație de 5 minute pe gheață. Reacția de transcriere inversă este adesea diluată înainte de PCR sau volumul de ADNc adăugat la PCR este limitat deoarece spermidina poate inhiba PCR (10). Această limitare poate afecta negativ capacitatea de a detecta ARN-uri cu abundență scăzută.

AMV RT este recomandat pentru RT-PCR într-un singur pas și în doi pași și RT-qPCR, transcrierea inversă a ARN-urilor < 5kb și extensia primerului, mai ales dacă ARN-ul șablon are o structură secundară puternică.