Como escolher a transcriptase reversa certa
A transcriptase reversa do vírus da mieloblastose aviária (AMV) é um dos RTs mais comuns usados em laboratório. O heterodímero de 170kDa requer 6–10 mM de Mg2 + ou Mn2 + para atividade, e as reações geralmente incluem pirofosfato de sódio e espermidina para aumentar a produção de cDNA de comprimento total e diminuir a formação de grampos de cabelo durante a síntese (3). AMV RT é menos sensível à inibição por forte estrutura secundária de RNA do que o vírus da leucemia murina Moloney (M-MLV) RT (4).
A atividade enzimática ideal e o comprimento máximo do cDNA ocorrem a 42-48 ° C, mas a temperatura da reação pode variar de 25 ° C a 58 ° C (5). A temperatura de reação mais alta ajuda a desnaturar regiões de forte estrutura secundária de RNA, o que pode fazer com que os RTs parem e limitem o tamanho do cDNA (6-7). Por esta razão, AMV RT é freqüentemente usado para reverter transcrever RNAs com forte estrutura secundária. Como outros RTs, AMV RT é compatível com primers específicos de gene, primers oligo (dT) 15 ou hexâmeros aleatórios, embora o uso de hexâmeros aleatórios exija uma temperatura de reação reduzida de 37 ° C. Primers RT específicos para genes com temperaturas de fusão adequadamente altas são recomendados quando a temperatura de reação excede 42 ° C.
Embora altas temperaturas de reação possam resolver efetivamente regiões de fortes estruturas secundárias, essas temperaturas são prejudiciais à integridade do RNA. O RNA é termolábil e suscetível à degradação catalisada por metal. Normalmente, a hidrólise ocorre em uma frequência baixa, mas a hidrólise do RNA se torna uma preocupação sob certas condições (por exemplo, pH não ótimo, altas temperaturas, a presença de cátions divalentes). Assim, a síntese de cDNA – em particular a síntese de cDNA de RNAs longos – se beneficia de não expor o RNA a temperaturas de reação mais altas. Para minimizar a quantidade de tempo que o RNA gasta em altas temperaturas, os protocolos de síntese de cDNA usando AMV e M-MLV RTs geralmente incorporam uma etapa de desnaturação inicial, onde o RNA e o primer de RT são combinados, brevemente aquecidos para ajudar a desnaturar qualquer estrutura secundária e, em seguida, resfriados rapidamente no gelo para manter o estado desnaturado. O RT, o tampão de reação e os dNTPs são adicionados e a reação é incubada na temperatura desejada.
O AMV RT possui uma atividade de RNase H intrínseca, que degrada a fita de RNA de um híbrido de RNA / DNA e pode clivar o modelo de RNA se a RT pausa durante a síntese (8). Isso reduz o rendimento total de cDNA e a porcentagem de cDNA de comprimento total, limitando a utilidade de AMV RT para reverter transcrever RNAs maiores que ~ 5kb.
Condições típicas de RT-PCR incluem o uso de até 5 µg do total RNA ou até 100ng de poliA + mRNA, 20–30 unidades de enzima e uma incubação de 60 minutos a 42 ° C. AMV RT é mais processivo do que M-MLV RT (5–6), portanto, menos unidades são necessárias para gerar a mesma quantidade de cDNA; 25 unidades de AMV RT são equivalentes a aproximadamente 200 unidades de M-MLV RT. Antes da PCR, o AMV deve ser inativado porque o AMV RT, como o M-MLV RT, pode inibir a Taq DNA polimerase (9). A enzima pode ser inativada por aquecimento a 70–100 ° C, seguido por uma incubação de 5 minutos em gelo. A reação de transcrição reversa é frequentemente diluída antes da PCR ou o volume de cDNA adicionado à PCR é limitado porque a espermidina pode inibir a PCR (10). Essa limitação pode afetar negativamente a capacidade de detectar RNAs de baixa abundância.
AMV RT é recomendado para RT-PCR e RT-qPCR de uma e duas etapas, transcrição reversa de RNAs < 5kb e extensão do primer, particularmente se o RNA modelo tiver uma estrutura secundária forte.