Wybór prawej odwrotnej transkryptazy

Odwrotna transkryptaza ptasiego wirusa mieloblastozy (AMV) jest jednym z najczęściej stosowanych w laboratorium RT. Heterodimer o masie 170 kDa wymaga 6–10 mM Mg2 + lub Mn2 + do działania, a reakcje często obejmują pirofosforan sodu i spermidynę w celu zwiększenia produkcji cDNA na całej długości i zmniejszenia tworzenia się spinek do włosów podczas syntezy (3). AMV RT jest mniej wrażliwa na hamowanie przez silną drugorzędową strukturę RNA niż RT mysiego wirusa białaczki Moloneya (M-MLV) (4).

Optymalna aktywność enzymatyczna i maksymalna długość cDNA występują w temperaturze 42–48 ° C, ale temperatura reakcji może wynosić od 25 ° C do 58 ° C (5). Wyższa temperatura reakcji pomaga w denaturacji regionów o silnej drugorzędowej strukturze RNA, co może powodować blokowanie RT i ograniczanie wielkości cDNA (6–7). Z tego powodu AMV RT jest często używany do odwrotnej transkrypcji RNA o silnej strukturze drugorzędowej. Podobnie jak inne RT, AMV RT jest kompatybilny ze starterami specyficznymi dla genu, starterami oligo (dT) 15 lub losowymi heksamerami, chociaż użycie losowych heksamerów wymaga obniżonej temperatury reakcji do 37 ° C. Specyficzne dla genów startery RT z odpowiednio wysokimi temperaturami topnienia są zalecane, gdy temperatura reakcji przekracza 42 ° C.

Chociaż wysokie temperatury reakcji mogą skutecznie rozwiązywać obszary silnych struktur drugorzędowych, temperatury te są szkodliwe dla integralności RNA. RNA jest termolabilne i podatne na degradację katalizowaną przez metal. Zwykle hydroliza zachodzi z niską częstotliwością, ale hydroliza RNA staje się problemem w pewnych warunkach (np. Nieoptymalne pH, wysokie temperatury, obecność dwuwartościowych kationów). Zatem synteza cDNA – w szczególności synteza cDNA długich RNA – korzysta z braku wystawiania RNA na wyższe temperatury reakcji. Aby zminimalizować ilość czasu spędzanego przez RNA w wysokich temperaturach, protokoły syntezy cDNA przy użyciu AMV i M-MLV RT często obejmują początkowy etap denaturacji, w którym starter RNA i RT są łączone, krótko podgrzewane, aby pomóc zdenaturować każdą strukturę drugorzędową, a następnie szybko schłodzić na lodzie, aby utrzymać denaturację. Dodaje się RT, bufor reakcyjny i dNTP, a reakcję inkubuje się w żądanej temperaturze.

AMV RT posiada wewnętrzną aktywność RNazy H, która degraduje nić RNA hybrydy RNA / DNA i może rozszczepiać matrycy RNA, jeśli RT zatrzymuje się podczas syntezy (8). Zmniejsza to całkowitą wydajność cDNA i procent pełnej długości cDNA, ograniczając przydatność AMV RT do odwrotnej transkrypcji RNA dłuższych niż ~ 5 kb.

Typowe warunki RT-PCR obejmują użycie do 5 µg całkowitego RNA lub do 100 ng mRNA poliA +, 20–30 jednostek enzymu i 60-minutowa inkubacja w 42 ° C. AMV RT jest bardziej przetwarzający niż M-MLV RT (5–6), więc do wygenerowania takiej samej ilości cDNA potrzeba mniej jednostek; 25 jednostek AMV RT odpowiada około 200 jednostkom M-MLV RT. Przed PCR AMV należy inaktywować, ponieważ AMV RT, podobnie jak M-MLV RT, może hamować polimerazę DNA Taq (9). Enzym można inaktywować przez ogrzewanie w temperaturze 70–100 ° C, a następnie 5-minutową inkubację na lodzie. Reakcja odwrotnej transkrypcji jest często rozcieńczana przed PCR lub objętość cDNA dodawanego do PCR jest ograniczona, ponieważ spermidyna może hamować PCR (10). To ograniczenie może negatywnie wpłynąć na zdolność wykrywania RNA o małej liczebności.

AMV RT jest zalecany do jednoetapowego i dwuetapowego RT-PCR i RT-qPCR, odwrotnej transkrypcji RNA < 5 kb i wydłużenie startera, szczególnie jeśli szablon RNA ma silną strukturę drugorzędową.