올바른 역전사 효소 선택

조류 골수 모세포 증 바이러스 (AMV) 역전사 효소는 실험실에서 가장 일반적으로 사용되는 RT 중 하나입니다. 170kDa heterodimer는 활성을 위해 6–10mM Mg2 + 또는 Mn2 +를 필요로하며, 반응에는 종종 전체 길이 cDNA 생성을 증가시키고 합성 중 헤어핀 형성을 감소시키기 위해 나트륨 피로 인산과 스 페르미 딘이 포함됩니다 (3). AMV RT는 Moloney 쥐 백혈병 바이러스 (M-MLV) RT (4)보다 강력한 RNA 2 차 구조에 의한 억제에 덜 민감합니다.

최적 효소 활성과 최대 cDNA 길이는 42 ~ 48 ° C에서 발생하지만 반응 온도는 25 ° C에서 58 ° C까지 다양합니다 (5). 더 높은 반응 온도는 강력한 RNA 2 차 구조의 영역을 변성시키는 데 도움이되며, 이로 인해 RT가 정지하고 cDNA 크기 (6–7)를 제한 할 수 있습니다. 이러한 이유로 AMV RT는 종종 강력한 2 차 구조를 가진 RNA를 역전사하는 데 사용됩니다. 다른 RT와 마찬가지로 AMV RT는 유전자 특이 적 프라이머, oligo (dT) 15 프라이머 또는 랜덤 6 량체와 호환되지만 랜덤 6 량체를 사용하려면 37 ° C의 감소 된 반응 온도가 필요합니다. 반응 온도가 42 ° C를 초과하는 경우 적절하게 높은 용융 온도를 가진 유전자 특이 적 RT 프라이머를 사용하는 것이 좋습니다.

높은 반응 온도가 강력한 2 차 구조의 영역을 효과적으로 분해 할 수 있지만 이러한 온도는 RNA 무결성에 해를 끼칩니다. RNA는 열에 불안정하고 금속 촉매로 분해되기 쉽습니다. 일반적으로 가수 분해는 낮은 빈도로 발생하지만 RNA 가수 분해는 특정 조건 (예 : 최적이 아닌 pH, 고온, 2가 양이온의 존재)에서 문제가됩니다. 따라서 cDNA 합성, 특히 긴 RNA의 cDNA 합성은 RNA를 더 높은 반응 온도에 노출시키지 않는 이점이 있습니다. RNA가 고온에서 소비하는 시간을 최소화하기 위해 AMV 및 M-MLV RT를 사용하는 cDNA 합성 프로토콜은 종종 RNA와 RT 프라이머가 결합 된 초기 변성 단계를 포함하고, 잠시 가열하여 2 차 구조를 변성시킨 다음 빠르게 냉각시킵니다. 변성 된 상태를 유지하기 위해 얼음 위에. RT, 반응 버퍼 및 dNTP가 추가되고 반응이 원하는 온도에서 배양됩니다.

AMV RT는 고유 한 RNase H 활성을 가지고있어 RNA / DNA 하이브리드의 RNA 가닥을 분해하고 절단 할 수 있습니다. RT가 합성 중에 일시 중지 된 경우 RNA 템플릿 (8). 이는 총 cDNA 수율과 전체 길이 cDNA의 비율을 줄여서 ~ 5kb보다 긴 RNA를 역전사하는 AMV RT의 유용성을 제한합니다.

일반적인 RT-PCR 조건에는 총 5µg까지의 사용이 포함됩니다. RNA 또는 최대 100ng의 polyA + mRNA, 20-30 단위의 효소 및 42 ° C에서 60 분 배양. AMV RT는 M-MLV RT (5–6)보다 더 처리 적이므로 동일한 양의 cDNA를 생성하는 데 필요한 장치 수가 더 적습니다. AMV RT 25 개는 M-MLV RT 약 200 개에 해당합니다. M-MLV RT와 같이 AMV RT가 Taq DNA 중합 효소를 억제 할 수 있기 때문에 PCR 전에 AMV를 비활성화해야합니다 (9). 효소는 70-100 ° C에서 가열 한 다음 얼음에서 5 분 동안 배양하여 비활성화 할 수 있습니다. 역전사 반응은 종종 PCR 전에 희석되거나 PCR에 추가되는 cDNA의 부피는 spermidine이 PCR을 억제 할 수 있기 때문에 제한됩니다 (10). 이 제한은 적은 양의 RNA를 감지하는 능력에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.

AMV RT는 1 단계 및 2 단계 RT-PCR 및 RT-qPCR, RNA의 역전사에 권장됩니다. < 5kb 및 프라이머 확장, 특히 주형 RNA가 강력한 2 차 구조를 갖는 경우