正しい逆転写酵素の選択

トリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）逆転写酵素は、ラボで使用される最も一般的なRTの1つです。 170kDaのヘテロダイマーは、活性のために6〜10mMのMg2 +またはMn2 +を必要とし、反応には、完全長のcDNA産生を増加させ、合成中のヘアピンの形成を減少させるために、ピロリン酸ナトリウムとスペルミジンが含まれることがよくあります（3）。 AMV RTは、モロニーマウス白血病ウイルス（M-MLV）RTよりも強力なRNA二次構造による阻害に対する感受性が低い（4）。

最適な酵素活性と最大cDNA長は、42〜48°Cで発生しますが、反応温度は25°Cから58°Cの範囲です（5）。より高い反応温度は、強力なRNA二次構造の領域を変性させるのに役立ち、RTを失速させ、cDNAサイズを制限する可能性があります（6–7）。このため、AMV RTは、強力な二次構造を持つRNAを逆転写するためによく使用されます。他のRTと同様に、AMV RTは遺伝子特異的プライマー、オリゴ（dT）15プライマー、またはランダムヘキサマーと互換性がありますが、ランダムヘキサマーを使用するには37°Cの低い反応温度が必要です。反応温度が42°Cを超える場合は、適切に高い融解温度を持つ遺伝子特異的RTプライマーをお勧めします。

高い反応温度は強力な二次構造の領域を効果的に分解できますが、これらの温度はRNAの完全性に悪影響を及ぼします。 RNAは熱に不安定で、金属触媒による分解を受けやすいです。通常、加水分解は低頻度で発生しますが、RNA加水分解は、特定の条件下（たとえば、最適でないpH、高温、二価カチオンの存在）で問題になります。したがって、cDNA合成、特に長鎖RNAのcDNA合成は、RNAをより高い反応温度にさらさないという利点があります。 RNAが高温で費やす時間を最小限に抑えるために、AMVおよびM-MLV RTを使用するcDNA合成プロトコルには、RNAとRTプライマーを組み合わせ、短時間加熱して二次構造の変性を助け、その後急速に冷却する初期変性ステップを組み込むことがよくあります。変性状態を維持するために氷上で。 RT、反応バッファー、dNTPを加え、反応を目的の温度でインキュベートします。

AMV RTは、RNA / DNAハイブリッドのRNA鎖を分解して切断できる固有のRNaseH活性を持っています。合成中にRTが一時停止した場合のRNAテンプレート（8）。これにより、総cDNA収量と完全長cDNAの割合が減少し、約5kbより長いRNAを逆転写するAMVRTの有用性が制限されます。

一般的なRT-PCR条件には、最大5µgの合計の使用が含まれます。 RNAまたは最大100ngのpolyA + mRNA、20〜30ユニットの酵素、42℃で60分間のインキュベーション。 AMVRTはM-MLVRT（5–6）よりもプロセッシブであるため、同じ量のcDNAを生成するために必要なユニットは少なくなります。 25ユニットのAMVRTは、約200ユニットのM-MLVRTに相当します。 M-MLVRTと同様にAMVRTはTaqDNAポリメラーゼを阻害する可能性があるため、PCRの前にAMVを不活性化する必要があります（9）。酵素は70〜100℃で加熱した後、氷上で5分間インキュベートすることで不活化できます。スペルミジンはPCRを阻害する可能性があるため、逆転写反応はPCRの前に希釈されるか、PCRに追加されるcDNAの量が制限されることがよくあります（10）。この制限は、少量のRNAを検出する能力に悪影響を与える可能性があります。

AMV RTは、1ステップおよび2ステップのRT-PCRおよびRT-qPCR、RNAの逆転写に推奨されます< 5kbおよびプライマー伸長、特にテンプレートRNAが強力な二次構造を持っている場合。