A megfelelő reverz transzkriptáz kiválasztása
A madár myeloblastosis vírus (AMV) reverz transzkriptáz az egyik leggyakoribb RT, amelyet a laboratóriumban használnak. A 170 kDa heterodimer aktivitásához 6–10 mM Mg2 + vagy Mn2 + szükséges, és a reakciók gyakran nátrium-pirofoszfátot és spermidint tartalmaznak a teljes hosszúságú cDNS termelésének növelése és a hajtűk kialakulásának csökkentése érdekében a szintézis során (3). Az AMV RT kevésbé érzékeny az erős RNS szekunder szerkezet által okozott gátlásra, mint a Moloney egér leukémia vírus (M-MLV) RT (4).
Optimális enzimaktivitás és maximális cDNS-hosszúság 42–48 ° C-on fordul elő, de a reakció hőmérséklete 25 ° C és 58 ° C között változhat (5). A magasabb reakcióhőmérséklet segíti az erős RNS szekunder szerkezet denaturálódását, ami az RT-k elakadását és a cDNS méretének korlátozását okozhatja (6–7). Emiatt az AMV RT-t gyakran használják az erős másodlagos szerkezetű RNS-ek átírására. Az egyéb RT-khez hasonlóan az AMV RT kompatibilis a génspecifikus primerekkel, az oligo (dT) 15 primerekkel vagy a random hexamerekkel, bár a véletlenszerű hexamerek alkalmazása csökkentett 37 ° C reakcióhőmérsékletet igényel. Ha a reakció hőmérséklete meghaladja a 42 ° C-ot, a génspecifikus, megfelelő olvadási hőmérsékletű RT-láncindítók ajánlottak. Az RNS termolabilis és hajlamos a fémek által katalizált lebontásra. Normális esetben a hidrolízis alacsony frekvencián megy végbe, de az RNS hidrolízise bizonyos körülmények között aggodalomra ad okot (például nem optimális pH, magas hőmérséklet, kétértékű kationok jelenléte esetén). Így a cDNS-szintézis – különösen a hosszú RNS-ek cDNS-szintézise – előnyös, ha nem teszi ki az RNS-t magasabb reakcióhőmérsékletnek. Az RNS magas hőmérsékleten eltöltött idejének minimalizálása érdekében az AMV és az M-MLV RT-ket alkalmazó cDNS-szintézis protokollok gyakran tartalmaznak egy kezdeti denaturálási lépést, ahol az RNS-t és az RT-primert kombinálják, rövid ideig felmelegítik, hogy elősegítsék a másodlagos struktúrák denaturálását, majd gyorsan lehűljenek. jégen a denaturált állapot fenntartása érdekében. Az RT-t, a reakciópuffert és a dNTP-ket hozzáadjuk, és a reakciót a kívánt hőmérsékleten inkubáljuk.
Az AMV RT belső RNáz H aktivitással rendelkezik, amely lebontja az RNS / DNS hibrid RNS-szálát, és hasíthat. az RNS-sablont, ha az RT a szintézis során szünetel (8). Ez csökkenti a teljes cDNS-hozamot és a teljes hosszúságú cDNS százalékos arányát, korlátozva az AMV RT hasznosságát a ~ 5kb-nál hosszabb RNS-ek reverz átírására.
A tipikus RT-PCR körülmények között legfeljebb 5µg teljes RNS vagy legfeljebb 100 ng polyA + mRNS, 20–30 egység enzim és 60 perces inkubálás 42 ° C-on. Az AMV RT processzívebb, mint az M-MLV RT (5–6), ezért kevesebb egységre van szükség ugyanolyan mennyiségű cDNS előállításához; 25 egység AMV RT kb. 200 egység M-MLV RT-nek felel meg. A PCR előtt az AMV-t inaktiválni kell, mert az AMV RT, mint az M-MLV RT, gátolhatja a Taq DNS-polimerázt (9). Az enzimet inaktiválhatjuk 70–100 ° C-os melegítéssel, majd 5 perces jégen inkubálhatjuk. A reverz transzkripciós reakciót gyakran hígítják a PCR előtt, vagy a PCR-hez hozzáadott cDNS mennyisége korlátozott, mivel a spermidin gátolhatja a PCR-t (10). Ez a korlátozás negatívan befolyásolhatja az alacsony bőségű RNS-ek kimutatásának képességét.
Az AMV RT ajánlott egylépéses és kétlépcsős RT-PCR és RT-qPCR esetén, az RNS-ek reverz transzkripciója < 5kb és primer kiterjesztés, különösen, ha a templát RNS erős másodlagos szerkezettel rendelkezik.