Výběr správné reverzní transkriptázy

reverzní transkriptáza viru ptačí myeloblastózy (AMV) je jednou z nejběžnějších RT používaných v laboratoři. Heterodimer 170 kDa vyžaduje pro aktivitu 6–10 mM Mg2 + nebo Mn2 + a reakce často zahrnují pyrofosforečnan sodný a spermidin, aby se zvýšila produkce cDNA v plné délce a snížila se tvorba vlásenek během syntézy (3). AMV RT je méně citlivý na inhibici silnou sekundární strukturou RNA než virus Moloney murine leukemia (M-MLV) RT (4).

Optimální aktivita enzymu a maximální délka cDNA se vyskytují při 42–48 ° C, ale reakční teplota se může pohybovat od 25 ° C do 58 ° C (5). Vyšší reakční teplota pomáhá denaturovat oblasti silné sekundární struktury RNA, což může způsobit zastavení RT a omezení velikosti cDNA (6–7). Z tohoto důvodu se AMV RT často používá k reverzní transkripci RNA se silnou sekundární strukturou. Stejně jako ostatní RT je AMV RT kompatibilní s genově specifickými primery, oligo (dT) 15 primery nebo náhodnými hexamery, ačkoli použití náhodných hexamerů vyžaduje sníženou reakční teplotu 37 ° C. Genové specifické primery RT s vhodně vysokými teplotami tání se doporučují, když reakční teplota překročí 42 ° C.

Ačkoli vysoké reakční teploty mohou účinně vyřešit oblasti silných sekundárních struktur, tyto teploty mají nepříznivý vliv na integritu RNA. RNA je termolabilní a citlivá na kovem katalyzovanou degradaci. K hydrolýze obvykle dochází při nízké frekvenci, ale hydrolýza RNA se za určitých podmínek stává problémem (např. Neoptimální pH, vysoké teploty, přítomnost dvojmocných kationtů). Syntéza cDNA – zejména syntéza cDNA dlouhých RNA – tedy těží z toho, že RNA není vystavena vyšším reakčním teplotám. Aby se minimalizovalo množství času, které RNA tráví při vysokých teplotách, protokoly syntézy cDNA využívající RT AMV a M-MLV často obsahují počáteční denaturační krok, kde se RNA a RT primer kombinují, krátce zahřívají, aby pomohly denaturovat jakoukoli sekundární strukturu, pak se rychle ochladí na ledu k udržení denaturovaného stavu. Přidá se RT, reakční pufr a dNTP a reakce se inkubuje při požadované teplotě.

AMV RT má vlastní aktivitu RNasy H, která degraduje RNA vlákno hybridu RNA / DNA a může se štěpit templát RNA, pokud se RT během syntézy pozastaví (8). To snižuje celkový výtěžek cDNA a procento cDNA plné délky, což omezuje užitečnost AMV RT pro reverzní transkripci RNA delší než ~ 5 kb.

Typické podmínky RT-PCR zahrnují použití až 5 µg celkového množství RNA nebo až 100 ng polyA + mRNA, 20–30 jednotek enzymu a 60minutová inkubace při 42 ° C. AMV RT je více procesní než M-MLV RT (5–6), takže ke generování stejného množství cDNA je zapotřebí méně jednotek; 25 jednotek AMV RT odpovídá přibližně 200 jednotkám M-MLV RT. Před PCR musí být AMV inaktivován, protože AMV RT, stejně jako M-MLV RT, může inhibovat Taq DNA polymerázu (9). Enzym lze inaktivovat zahřátím na 70–100 ° C a následnou 5minutovou inkubací na ledu. Reverzní transkripční reakce se před PCR často ředí nebo je objem cDNA přidané k PCR omezený, protože spermidin může inhibovat PCR (10). Toto omezení může negativně ovlivnit schopnost detekovat RNA s nízkou četností.

AMV RT se doporučuje pro jednokrokové a dvoustupňové RT-PCR a RT-qPCR, reverzní transkripce RNA < 5kb a rozšíření primeru, zvláště pokud má templátová RNA silnou sekundární strukturu.