G2-fase (Dansk)

Mitotisk indgang bestemmes af et tærskelniveau for aktiv cyclin-B1 / CDK1-kompleks, også kendt som cyclin-B1 / Cdc2 eller modningsfremmende faktor (MPF). Aktiv cyclin-B1 / CDK1 udløser irreversible handlinger i tidlig mitose, herunder centrosomseparation, nedbrydning af nuklear konvolut og samling af spindel. Hos hvirveldyr er der fem cyclin B-isoformer (B1, B2, B3, B4 og B5), men hver af disse isoformers specifikke rolle i reguleringen af mitotisk indgang er stadig uklar. Det er kendt, at cyclin B1 kan kompensere for tab af både cyclin B2 (og omvendt i Drosophila). Saccharomyces cerevisiae indeholder seks cykliner af B-typen (Clb1-6), hvor Clb2 er den mest essentielle for funktion. Hos både hvirveldyr og S. cerevisiae spekuleres det i, at tilstedeværelsen af multiple B-type cykliner tillader forskellige cykliner at regulere forskellige dele af G2 / M-overgangen, samtidig med at overgangen gøres robust for forstyrrelser.

Efterfølgende diskussioner vil fokusere på den rumlige og tidsmæssige aktivering af cyclin B1 / CDK i pattedyrceller, men lignende veje er anvendelige i både andre metazoaner og i S. cerevisiae.

Cyclin B1-syntese og nedbrydning Rediger

Cyclin B1-niveauer undertrykkes gennem G1- og S-faser af det anafasefremmende kompleks (APC), en E3 ubiquitinligase, der er målrettet mod cyclin B1 til proteolyse. Transkription begynder ved afslutningen af S-fasen efter DNA-replikation som reaktion på phosphorylering af transkriptionsfaktorer såsom NF-Y, FoxM1 og B-Myb af opstrøms G1 og G1 / S cyclin-CDK-komplekser.

Regulering af cyclin-B1 / CDK1-aktivitet Rediger

Forøgede niveauer af cyclin B1 forårsager stigende niveauer af cyclin B1-CDK1-komplekser i hele G2, men komplekset forbliver inaktivt før G2 / M-overgangen på grund af hæmmende phosphorylering af Wee1 og Myt1-kinaser. Wee1 er lokaliseret primært til kernen og virker på Tyr15-stedet, mens Myt1 er lokaliseret til den ydre overflade af ER og virker overvejende på Thr14-stedet.

Virkningerne af Wee1 og Myt1 modvirkes af phosphataser i cdc25-familien, som fjerner de inhiberende phosphater på CDK1 og således omdanner cyclin B1-CDK1-komplekset til dets fuldt aktiverede form, MPF.

Aktiv cyclinB1-CDK1 phosphorylerer og modulerer aktiviteten af Wee1 og Cdc25-isoformerne A og C. Specifikt inhiberer CDK1-phosphorylering Wee1-kinaseaktivitet, aktiverer Cdc25C-phosphatase-aktivitet via aktivering af den mellemliggende kinase PLK1 og stabiliserer Cdc25A. CDK1 danner således en positiv feedback-loop med Cdc25 og en dobbelt negativ feedback-loop med Wee1 (i det væsentlige en nettopositiv feedback-loop).

Positiv feedback og switch-lignende aktivering Rediger

Disse positive feedback-sløjfer koder for en hysteretisk bistabil switch i CDK1-aktivitet i forhold til cyclin B1-niveauer (se figur). Denne switch er kendetegnet ved to forskellige stabile ligevægter over et bistabilt område med cyclin B1-koncentrationer. En ligevægt svarer til interfase og er kendetegnet ved inaktivitet af Cyclin-B1 / CDK1 og Cdc25 og et højt niveau af Wee1- og Myt1-aktivitet. Den anden ligevægt svarer til M-fase og er kendetegnet ved høj aktivitet af Cyclin-B1 / CDK1 og Cdc25 og lav Wee1- og Myt1-aktivitet. Inden for området bistabilitet afhænger en celles tilstand af, om den tidligere var i interfase eller M-fase: tærskelkoncentrationen for at komme ind i M-fase er højere end den minimale koncentration, der opretholder M-fase-aktivitet, når en celle allerede har forladt interfasen .

Forskere har både teoretisk og empirisk valideret den bistabile karakter af G2 / M-overgangen. Novak-Tyson-modellen viser, at differentialligningerne, der modellerer cyclin-B / CDK1-cdc25-Wee1-Myt1-feedbacksløjfen, tillader to stabile ligevægter over en række cyclin-B-koncentrationer. Eksperimentelt er bistabilitet blevet valideret ved at blokere endogen cyclin B1-syntese og titrerende interfase- og M-fase-celler med varierende koncentrationer af ikke-nedbrydeligt cyclin B1.Disse eksperimenter viser, at tærskelkoncentrationen for at komme ind i M-fase er højere end tærsklen for udgang af M-fase: nedbrydning af nuklear konvolut forekommer mellem 32-40 nm cyclin-B1 for celler, der forlader interfase, mens kernen forbliver disintegreret i koncentrationer over 16-24 nm i celler, der allerede er i M-fase.

Denne bistabile, hysteretiske switch er fysiologisk nødvendig af mindst tre grunde. For det første signalerer G2 / M-overgangen initieringen af flere begivenheder, såsom kromosomkondensation og nedbrydning af nuklear konvolut, der markant ændrer cellens morfologi og kun er levedygtige i delende celler. Det er derfor vigtigt, at cyclin-B1 / CDK1-aktivering finder sted på en switch-lignende måde; det vil sige at celler hurtigt skal sætte sig i en diskret M-fase tilstand efter overgangen og ikke skal vare i et kontinuum af mellemtilstande (f.eks. med en delvis nedbrudt nuklear hylster). Dette krav er opfyldt ved den skarpe diskontinuitet, der adskiller interfase- og M-fase-ligevægtsniveauerne af CDK1-aktivitet; da cyclin-B-koncentrationen stiger ud over aktiveringstærsklen, skifter cellen hurtigt til M-fase-ligevægt.

For det andet er det også vigtigt, at G2 / M-overgangen sker ensrettet eller kun en gang pr. celle cyklus Biologiske systemer er i sagens natur støjende, og små udsving i koncentrationer af cyclin B1 nær tærsklen for G2 / M-overgangen bør ikke få cellen til at skifte frem og tilbage mellem mellemfase- og M-fase-tilstande. Dette sikres ved hjælp af switchens bistabile natur: Efter celleovergang til M-fase-tilstand får små fald i koncentrationen af cyclin B ikke cellen til at skifte tilbage til mellemfase.

Endelig, fortsættelsen af cellecyklussen kræver vedvarende svingninger i cyclin-B / CDK1-aktivitet, når cellen og dens efterkommere overgår ind og ud af M-fase. Negativ feedback giver et væsentligt element i denne langsigtede svingning: cyclin-B / CDK aktiverer APC / C, som forårsager nedbrydning af cyclin-B fra metafase og frem, hvilket gendanner CDK1 til dets inaktive tilstand. Imidlertid fører enkle negative feedback-sløjfer til dæmpede svingninger, der til sidst sætter sig i en stabil tilstand. Kinetiske modeller viser, at negative feedback-sløjfer kombineret med bistabile positive feedback-motiver kan føre til vedvarende, ikke-dæmpede svingninger (se afslapningsoscillator) af den slags, der kræves til langvarig cellecykling.

Positiv feedbackRediger

Den positive feedback-loop, der er nævnt ovenfor, hvor cyclin-B1 / CDK1 fremmer sin egen aktivering ved at hæmme Wee1 og Myst1 og aktivering af cdc25, inkluderer ikke i sig selv en “trigger ”Mekanisme til at starte feedback-sløjfen. For nylig er der fremkommet beviser, der tyder på en vigtigere rolle for cyclin A2 / CDK-komplekser i reguleringen af initieringen af denne switch. Cyclin A2 / CDK2-aktivitet begynder i den tidlige S-fase og øges under G2. Cdc25B har været vist at dephosphorylere Tyr15 på CDK2 tidligt til midten af G2 på en måde svarende til den førnævnte CDK1-mekanisme. Nedregulering af cyclin A2 i U2OS-celler forsinker cyclin-B1 / CDK1-aktivering ved at øge Wee1-aktivitet og sænke Plk1- og Cdc25C-aktivitet. cyclin A2 / CDK-komplekser fungerer ikke strengt som aktivatorer af cyclin B1 / CDK1 i G2, da CDK2 har vist sig at være påkrævet til aktivering af den p53-uafhængige G2-kontrolpunktsaktivitet, måske gennem en stabiliserende phosphorylering på C dc6. CDK2 – / – celler har også afvigende høje niveauer af Cdc25A. Cyclin A2 / CDK1 har også vist sig at formidle proteasomal destruktion af Cdc25B. Disse veje er dereguleret ofte i kræft.

Rumlig reguleringEdit

Ud over de bistabile og hysteretiske aspekter af cyclin B1-CDK1-aktivering bidrager regulering af subcellulær proteinlokalisering også til G2 / M overgang. Inaktiv cyclin B1-CDK1 akkumuleres i cytoplasmaet, begynder at blive aktiveret af cytoplasmatisk cdc25 og sekvestreres derefter hurtigt i kernen under profase (som den yderligere aktiveres). Hos pattedyr aktiveres cyclin B1 / CDK1-translokation til kernen ved phosphorylering af fem serinsites på cyclin B1s cytoplasmatiske retentionssted (CRS): S116, S26, S128, S133 og S147. I Xenopus laevis indeholder cyclin B1 fire analoge CRS-serinfosforyleringssteder (S94, S96, S101 og S113), hvilket indikerer, at denne mekanisme er meget konserveret. Nuklear eksport inaktiveres også ved phosphorylering af cyclin B1 “s nukleare eksport signal (NES). Regulatorerne af disse phosphoryleringssteder er stadig stort set ukendte, men flere faktorer er blevet identificeret, herunder ekstracellulære signalregulerede kinaser (ERKer), PLK1 og selve CDK1. Efter at have nået noget tærskelniveau for phosphorylering er translokation af cyclin B1 / CDK1 til kernen ekstremt hurtig.En gang i kernen phosphorylerer cyclin B1 / CDK1 mange mål som forberedelse til mitose, herunder histon H1, nukleare laminer, centrosomale proteiner og mikrotubulusassocierede proteiner (MAPer).

Den subcellulære lokalisering af cdc25 skifter også fra cytosolen til kernen under profase. Dette opnås via fjernelse af nuklear lokaliseringssekvens (NLS) -obscuring af phosphater og phosphorylering af det nukleare eksportsignal. Det antages, at den samtidige transport af cdc25 og cyclin-B1 / CDK1 ind i kernen forstærker den switch-lignende natur af overgangen ved at øge de effektive koncentrationer af proteinerne.