G2-fas
Mitotisk inmatning bestäms av en tröskelnivå för aktivt cyklin-B1 / CDK1-komplex, även känd som cyklin-Bl / Cdc2 eller mognadsfrämjande faktor (MPF). Aktiv cyklin-B1 / CDK1 utlöser irreversibla åtgärder vid tidig mitos, inklusive centrosomseparation, kärnhöljeuppdelning och spindelmontering. Hos ryggradsdjur finns det fem cyklin B-isoformer (B1, B2, B3, B4 och B5), men den specifika rollen för var och en av dessa isoformer för att reglera mitotisk inträde är fortfarande oklar. Det är känt att cyklin B1 kan kompensera för förlust av både cyklin B2 (och vice versa i Drosophila). Saccharomyces cerevisiae innehåller sex cykliner av B-typ (Clb1-6), varvid Clb2 är det viktigaste för funktionen. I både ryggradsdjur och S. cerevisiae spekuleras det att närvaron av flera cykliner av B-typ tillåter olika cykliner att reglera olika delar av G2 / M-övergången samtidigt som övergången görs robust för störningar.
Efterföljande diskussioner kommer att fokusera på den rumsliga och temporala aktiveringen av cyklin B1 / CDK i däggdjursceller, men liknande vägar är tillämpliga i både andra metazoaner och i S. cerevisiae.
Cyclin B1-syntes och nedbrytning Redigera
Cyclin B1-nivåer undertrycks genom G1- och S-faserna av det anafasfrämjande komplexet (APC), ett E3-ubikitinligas som riktar sig mot cyklin B1 för proteolys. Transkription börjar i slutet av S-fasen efter DNA-replikering, som svar på fosforylering av transkriptionsfaktorer såsom NF-Y, FoxM1 och B-Myb av uppströms G1 och G1 / S cyklin-CDK-komplex.
Reglering av cyklin-B1 / CDK1-aktivitet Redigera
Ökade nivåer av cyklin B1 orsakar stigande nivåer av cyklin B1-CDK1-komplex genom hela G2, men komplexet förblir inaktivt före G2 / M-övergången på grund av hämmande fosforylering av Wee1 och Mytl-kinaser. Wee1 är primärt lokaliserat till kärnan och verkar på Tyr15-stället, medan Myt1 är lokaliserat till ytterytan av ER och verkar övervägande på Thr14-platsen.
Effekterna av Wee1 och Myt1 motverkas av fosfataser i cdc25-familjen, som avlägsnar de hämmande fosfaterna på CDK1 och därmed omvandlar cyklin B1-CDK1-komplexet till dess fullt aktiverade form, MPF.
Detta diagram illustrerar återkopplingsslingorna som ligger till grund för G2 / M-övergången. Cyclin-B1 / CDK1 aktiverar Plk och inaktiverar Wee1 och Myt1. Aktiverad Plk aktiverar cdc25. Aktivering av Cdc25 och inaktivering av Wee1 / Myt1 leder till ytterligare aktivering av Cyclin-B1 / CDK1. Visas också den förmodade rollen för cyklin-A / CDK2 och Cdc25A som initiala aktivatorer för återkopplingsslingan, diskuterad i ett senare avsnitt.
Aktiv cyklinB1-CDK1 fosforylerar och modulerar aktiviteten för Wee1 och Cdc25-isoformerna A och C. Specifikt hämmar CDK1-fosforylering Wee1-kinasaktivitet, aktiverar Cdc25C-fosfatasaktivitet via aktivering av det mellanliggande kinaset PLK1 och stabiliserar Cdc25A. Således bildar CDK1 en positiv återkopplingsslinga med Cdc25 och en dubbel negativ återkopplingsslinga med Wee1 (i huvudsak en nettopositiv återkopplingsslinga).
Positiv återkoppling och omkopplarliknande aktivering Redigera
Denna graf illustrerar stabil jämvikt för cyklin-B1 / CDK1-aktivitet vid varierande cyklin B1-koncentrationer, med tröskeln för cyklin B-koncentration för att komma in i mitos högre än tröskeln för att avsluta mitos.
Dessa positiva återkopplingsslingor kodar för en hysteretisk bistabil omkopplare i CDK1-aktivitet i förhållande till cyklin B1-nivåer (se figur). Denna omkopplare kännetecknas av två distinkta stabila jämvikter över en bistabil region av cyklin B1-koncentrationer. En jämvikt motsvarar interfas och kännetecknas av inaktivitet av Cyclin-B1 / CDK1 och Cdc25, och en hög nivå av Wee1- och Myt1-aktivitet. Den andra jämvikten motsvarar M-fas och kännetecknas av hög aktivitet av Cyclin-Bl / CDK1 och Cdc25, och låg Wee1- och Myt1-aktivitet. Inom bistabilitetsområdet beror en cells tillstånd på om den tidigare var i interfas eller M-fas: tröskelkoncentrationen för att komma in i M-fas är högre än den minsta koncentration som kommer att upprätthålla M-fasaktivitet när en cell redan har lämnat fas .
Forskare har både teoretiskt och empiriskt validerat G2 / M-övergångens bistabila natur. Novak-Tyson-modellen visar att differentialekvationerna som modellerar cyklin-B / CDK1-cdc25-Wee1-Myt1-återkopplingsslingan tillåter två stabila jämvikter över ett intervall av cyklin-B-koncentrationer. Experimentellt har bistabilitet validerats genom att blockera endogen cyklin B1-syntes och titrerande interfas- och M-fasceller med varierande koncentrationer av icke-nedbrytbar cyklin B1.Dessa experiment visar att tröskelkoncentrationen för att komma in i M-fas är högre än tröskeln för att lämna M-fas: kärnhöljeuppdelning sker mellan 32-40 nm cyklin-B1 för celler som lämnar fas, medan kärnan förblir upplöst vid koncentrationer ovan 16-24 nm i celler som redan är i M-fas.
Denna bistabila, hysteretiska omkopplare är fysiologiskt nödvändig av minst tre skäl. För det första signalerar G2 / M-övergången initieringen av flera händelser, såsom kromosomkondensation och kärnhöljeuppdelning, som markant förändrar cellens morfologi och endast är livskraftiga i delande celler. Det är därför viktigt att cyklin-B1 / CDK1-aktivering sker på ett omkopplarliknande sätt; det vill säga celler bör snabbt sätta sig i ett diskret M-fas-tillstånd efter övergången och bör inte bestå i en kontinuerlig del av mellanliggande tillstånd (t.ex. med ett delvis sönderdelat kärnhölje). Detta krav uppfylls av den skarpa diskontinuiteten som skiljer mellanfas- och M-fas-jämviktsnivåerna av CDK1-aktivitet; när cyklin-B-koncentrationen ökar över aktiveringströskeln, växlar cellen snabbt till M-fasens jämvikt.
För det andra är det också viktigt att G2 / M-övergången sker enkelriktad eller bara en gång per cell cykel Biologiska system är i sig bullriga och små fluktuationer i cyklin B1-koncentrationer nära tröskeln för G2 / M-övergången bör inte få cellen att växla fram och tillbaka mellan mellanfas och M-fas. Detta säkerställs av switchens bistabila natur: efter cellövergången till M-fas-tillståndet får små minskningar av koncentrationen av cyklin B inte cellen att växla tillbaka till interfas.
Slutligen, fortsättningen av cellcykeln kräver ihållande svängningar i cyklin-B / CDK1-aktivitet när cellen och dess ättlingar övergår i och ut ur M-fas. Negativ återkoppling ger ett väsentligt inslag i denna långvariga svängning: cyklin-B / CDK aktiverar APC / C, vilket orsakar nedbrytning av cyklin-B från metafas och framåt och återställer CDK1 till dess inaktiva tillstånd. Men enkla negativa återkopplingsslingor leder till dämpade svängningar som så småningom sätter sig i ett stabilt tillstånd. Kinetiska modeller visar att negativa återkopplingsslingor i kombination med bistabila positiva återkopplingsmotiv kan leda till ihållande, icke-dämpade svängningar (se avslappningsoscillator) av det slag som krävs för långvarig cellcykling.
Positiv feedbackRedigera
Den positiva återkopplingsslingan som nämns ovan, i vilken cyclin-B1 / CDK1 främjar sin egen aktivering genom att hämma Wee1 och Myst1 och aktivera cdc25, inkluderar inte i sig en ”trigger” ”Mekanism för att initiera återkopplingsslingan. Nyligen har bevis framkommit som tyder på en viktigare roll för cyklin A2 / CDK-komplex vid reglering av initieringen av denna switch. Cyclin A2 / CDK2-aktivitet börjar i tidig S-fas och ökar under G2. Cdc25B har varit visat sig avfosforylera Tyr15 på CDK2 i tidig till mitten av G2 på ett sätt som liknar den tidigare nämnda CDK1-mekanismen. Nedreglering av cyklin A2 i U2OS-celler fördröjer cyklin-B1 / CDK1-aktivering genom att öka Wee1-aktiviteten och sänka Plk1- och Cdc25C-aktiviteten. cyklin A2 / CDK-komplex fungerar inte strikt som aktivatorer av cyklin B1 / CDK1 i G2, eftersom CDK2 har visats krävas för aktivering av den p53-oberoende G2-kontrollpunktaktiviteten, kanske genom en stabiliserande fosforylering på C dc6. CDK2 – / – celler har också avvikande höga nivåer av Cdc25A. Cyclin A2 / CDK1 har också visat sig förmedla proteasomal förstörelse av Cdc25B. Dessa vägar avregleras ofta i cancer.
Rumslig regleringRedigera
Förutom de bistabila och hysteretiska aspekterna av cyklin B1-CDK1-aktivering bidrar också reglering av subcellulär proteinlokalisering till G2 / M övergång. Inaktiv cyklin B1-CDK1 ackumuleras i cytoplasman, börjar aktiveras av cytoplasmatisk cdc25 och sekvestreras sedan snabbt i kärnan under profas (eftersom den aktiveras ytterligare). Hos däggdjur aktiveras cyklin B1 / CDK1-translokation till kärnan genom fosforylering av fem serinsäten på cyklin B1: s cytoplasmatiska retentionsställe (CRS): S116, S26, S128, S133 och S147. I Xenopus laevis innehåller cyklin B1 fyra analoga CRS-serinfosforyleringsställen (S94, S96, S101 och S113) vilket indikerar att denna mekanism är mycket konserverad. Kärnkortsexport inaktiveras också av fosforylering av cyklin B1: s kärnexportsignal (NES). Regulatorerna för dessa fosforyleringsställen är fortfarande i stort sett okända men flera faktorer har identifierats, inklusive extracellulära signalreglerade kinaser (ERK), PLK1 och CDK1 själv. Efter att ha nått en viss tröskelnivå för fosforylering är translokation av cyklin B1 / CDK1 till kärnan extremt snabb.En gång i kärnan fosforylerar cyklin B1 / CDK1 många mål som förberedelse för mitos, inklusive histon H1, nukleära laminer, centrosomala proteiner och mikrotubuliassocierade proteiner (MAP).
Den subcellulära lokaliseringen av cdc25 skiftar också från cytosolen till kärnan under profas. Detta åstadkoms genom avlägsnande av kärnlokaliseringssekvens (NLS) -obscuring fosfater och fosforylering av kärnkortsexportsignalen. Man tror att den samtidiga transporten av cdc25 och cyklin-B1 / CDK1 in i kärnan förstärker den omkopplarliknande naturen hos övergången genom att öka de effektiva koncentrationerna av proteinerna.