G2-fase
Mitotische intrede wordt bepaald door een drempelniveau van actief cycline-B1 / CDK1-complex, ook bekend als cycline-B1 / Cdc2 of de rijpingsbevorderende factor (MPF). Actief cycline-B1 / CDK1 triggert onomkeerbare acties bij vroege mitose, inclusief centrosoomscheiding, afbraak van nucleaire enveloppen en spilassemblage. Bij gewervelde dieren zijn er vijf cycline B-isovormen (B1, B2, B3, B4 en B5), maar de specifieke rol van elk van deze isovormen bij het reguleren van mitotische intrede is nog onduidelijk. Het is bekend dat cycline B1 het verlies van zowel cycline B2 (en vice versa in Drosophila) kan compenseren. Saccharomyces cerevisiae bevat zes B-type cyclinen (Clb1-6), waarbij Clb2 het meest essentieel is voor het functioneren. Bij zowel gewervelde dieren als S. cerevisiae wordt gespeculeerd dat de aanwezigheid van meerdere B-type cyclinen het mogelijk maakt dat verschillende cyclinen verschillende delen van de G2 / M-overgang reguleren en tegelijkertijd de overgang robuust maken voor verstoringen.
discussies zullen zich richten op de ruimtelijke en temporele activering van cycline B1 / CDK in zoogdiercellen, maar vergelijkbare routes zijn toepasbaar in zowel andere metazoans als in S. cerevisiae.
Cycline B1-synthese en -afbraak Bewerken
Cycline B1-niveaus worden tijdens de G1- en S-fasen onderdrukt door het anafase-bevorderende complex (APC), een E3-ubiquitine-ligase dat cycline B1 als doelwit heeft voor proteolyse. Transcriptie begint aan het einde van de S-fase na DNA-replicatie, als reactie op fosforylering van transcriptiefactoren zoals NF-Y, FoxM1 en B-Myb door stroomopwaartse G1- en G1 / S cycline-CDK-complexen.
Regulatie van cycline-B1 / CDK1-activiteit Bewerken
Verhoogde niveaus van cycline B1 veroorzaken stijgende niveaus van cycline B1-CDK1-complexen in G2, maar het complex blijft inactief voorafgaand aan de G2 / M-overgang vanwege remmende fosforylering door de Wee1 en Myt1-kinasen. Wee1 is voornamelijk gelokaliseerd in de kern en werkt op de Tyr15-site, terwijl Myt1 is gelokaliseerd op het buitenoppervlak van de ER en voornamelijk inwerkt op de Thr14-site.
De effecten van Wee1 en Myt1 worden tegengegaan door fosfatasen in de cdc25-familie, die de remmende fosfaten op CDK1 verwijderen en zo het cycline B1-CDK1-complex omzetten in zijn volledig geactiveerde vorm, MPF.
Dit diagram illustreert de feedbackloops die ten grondslag liggen aan de G2 / M-overgang. Cyclin-B1 / CDK1 activeert Plk en deactiveert Wee1 en Myt1. Geactiveerde Plk activeert cdc25. Activering van Cdc25 en inactivering van Wee1 / Myt1 leiden tot verdere activering van Cyclin-B1 / CDK1. Ook getoond is de vermeende rol van cycline-A / CDK2 en Cdc25A als initiële activatoren van de feedbacklus, besproken in een later gedeelte.
Actief cyclinB1-CDK1 fosforyleert en moduleert de activiteit van Wee1 en de Cdc25-isovormen A en C. Specifiek remt CDK1-fosforylering de Wee1-kinaseactiviteit, activeert het Cdc25C-fosfataseactiviteit door het tussenliggende kinase PLK1 te activeren en stabiliseert Cdc25A. CDK1 vormt dus een positieve terugkoppelingslus met Cdc25 en een dubbele negatieve terugkoppelingslus met Wee1 (in wezen een netto positieve terugkoppelingslus).
Positieve terugkoppeling en switch-achtige activeringEdit
Deze grafiek illustreert de stabiele evenwichten voor cycline-B1 / CDK1-activiteit bij variërende cycline B1-concentraties, waarbij de drempel van cycline B-concentratie voor het betreden van mitose hoger is dan de drempel voor het verlaten van de mitose.
Deze positieve terugkoppelingslussen coderen voor een hysteretische bistabiele schakelaar in CDK1-activiteit ten opzichte van cycline B1-niveaus (zie figuur). Deze omschakeling wordt gekenmerkt door twee verschillende stabiele evenwichten over een bistabiel gebied van cycline B1-concentraties. Eén evenwicht komt overeen met interfase en wordt gekenmerkt door inactiviteit van Cyclin-B1 / CDK1 en Cdc25, en een hoog niveau van Wee1- en Myt1-activiteit. Het andere evenwicht komt overeen met de M-fase en wordt gekenmerkt door een hoge activiteit van Cyclin-B1 / CDK1 en Cdc25 en een lage Wee1- en Myt1-activiteit. Binnen het bereik van bistabiliteit hangt de toestand van een cel af van het feit of deze zich eerder in de interfase of de M-fase bevond: de drempelconcentratie voor het ingaan van de M-fase is hoger dan de minimumconcentratie die de M-fase-activiteit zal ondersteunen zodra een cel de interfase al heeft verlaten .
Wetenschappers hebben zowel theoretisch als empirisch de bistabiele aard van de G2 / M-overgang gevalideerd. Het Novak-Tyson-model laat zien dat de differentiaalvergelijkingen die de cycline-B / CDK1-cdc25-Wee1-Myt1-terugkoppellus modelleren, twee stabiele evenwichten toelaten over een reeks cycline-B-concentraties. Experimenteel is de bistabiliteit gevalideerd door de endogene cycline B1-synthese te blokkeren en interfase- en M-fase-cellen te titreren met verschillende concentraties van niet-afbreekbaar cycline B1.Deze experimenten tonen aan dat de drempelconcentratie voor het ingaan van de M-fase hoger is dan de drempel voor het verlaten van de M-fase: afbraak van de nucleaire envelop vindt plaats tussen 32-40 nm cycline-B1 voor cellen die de interfase verlaten, terwijl de kern gedesintegreerd blijft bij concentraties boven 16-24 nm in cellen die zich al in M-fase bevinden.
Deze bistabiele, hysteretische schakelaar is fysiologisch noodzakelijk om minstens drie redenen. Ten eerste signaleert de G2 / M-overgang het begin van verschillende gebeurtenissen, zoals chromosoomcondensatie en afbraak van de nucleaire envelop, die de morfologie van de cel aanzienlijk veranderen en alleen levensvatbaar zijn in delende cellen. Het is daarom essentieel dat cycline-B1 / CDK1-activering plaatsvindt op een schakelaarachtige manier; dat wil zeggen dat cellen zich na de overgang snel in een discrete M-fasetoestand moeten vestigen en niet moeten blijven bestaan in een continuüm van tussenliggende toestanden (bijv. met een gedeeltelijk afgebroken nucleair omhulsel). Aan deze eis wordt voldaan door de scherpe discontinuïteit die de interfase- en M-fase-evenwichtsniveaus van CDK1-activiteit scheidt; naarmate de cycline-B-concentratie boven de activeringsdrempel stijgt, schakelt de cel snel over naar het M-fase-evenwicht.
Ten tweede is het ook van vitaal belang dat de G2 / M-overgang in één richting plaatsvindt, of slechts één keer per cel cyclus Biologische systemen zijn inherent luidruchtig, en kleine fluctuaties in cycline B1-concentraties nabij de drempel voor de G2 / M-overgang zouden er niet voor moeten zorgen dat de cel heen en weer schakelt tussen interfase- en M-fasetoestanden. Dit wordt verzekerd door de bistabiele aard van de omschakeling: nadat de cel overgaat naar de M-fasetoestand, zorgen kleine dalingen in de concentratie van cycline B er niet voor dat de cel terugschakelt naar interfase.
Ten slotte, de voortzetting van de celcyclus vereist aanhoudende oscillaties in cycline-B / CDK1-activiteit terwijl de cel en zijn nakomelingen in en uit de M-fase gaan. Negatieve feedback vormt een essentieel element van deze langdurige oscillatie: cycline-B / CDK activeert APC / C, wat de afbraak van cycline-B vanaf de metafase veroorzaakt, waardoor CDK1 in zijn inactieve toestand wordt hersteld. Eenvoudige negatieve terugkoppellussen leiden echter tot gedempte oscillaties die uiteindelijk in een stabiele toestand terechtkomen. Kinetische modellen laten zien dat negatieve feedbackloops in combinatie met bistabiele positieve feedbackmotieven kunnen leiden tot aanhoudende, niet-gedempte oscillaties (zie relaxatie-oscillator) van het soort dat nodig is voor langdurige celcycli.
Positieve feedback Bewerken
De hierboven genoemde positieve feedbacklus, waarin cyclin-B1 / CDK1 zijn eigen activering bevordert door Wee1 en Myst1 te remmen en cdc25 te activeren, bevat niet inherent een trigger “Mechanisme om de feedbacklus op gang te brengen. Onlangs is er bewijs naar voren gekomen dat suggereert dat cycline A2 / CDK-complexen een belangrijkere rol spelen bij het reguleren van de initiatie van deze omschakeling. Cycline A2 / CDK2-activiteit begint in de vroege S-fase en neemt toe tijdens G2. aangetoond dat het Tyr15 op CDK2 defosforyleert in vroege tot midden G2 op een manier die vergelijkbaar is met het eerder genoemde CDK1-mechanisme. Downregulatie van cycline A2 in U2OS-cellen vertraagt cycline-B1 / CDK1-activering door Wee1-activiteit te verhogen en Plk1- en Cdc25C-activiteit te verlagen. cycline A2 / CDK-complexen functioneren niet strikt als activatoren van cycline B1 / CDK1 in G2, aangezien is aangetoond dat CDK2 vereist is voor activering van de p53-onafhankelijke G2-ijkpuntactiviteit, misschien door een stabiliserende fosforylering op C dc6. CDK2 – / – cellen hebben ook afwijkend hoge niveaus van Cdc25A. Van cycline A2 / CDK1 is ook aangetoond dat het proteasomale vernietiging van Cdc25B medieert. Deze routes zijn vaak gedereguleerd bij kanker.
Ruimtelijke regulatieEdit
Naast de bistabiele en hysteretische aspecten van cycline B1-CDK1-activering, draagt regulatie van subcellulaire eiwitlokalisatie ook bij aan de G2 / M overgang. Inactief cycline B1-CDK1 hoopt zich op in het cytoplasma, begint te worden geactiveerd door cytoplasmatisch cdc25 en wordt vervolgens snel gesekwestreerd in de kern tijdens profase (terwijl het verder wordt geactiveerd). Bij zoogdieren wordt cycline B1 / CDK1-translocatie naar de kern geactiveerd door fosforylering van vijf serineplaatsen op de cytoplasmatische retentieplaats (CRS) van cycline B1: S116, S26, S128, S133 en S147. In Xenopus laevis bevat cycline B1 vier analoge CRS-serinefosforyleringsplaatsen (S94, S96, S101 en S113), wat aangeeft dat dit mechanisme sterk geconserveerd is. Nucleaire export wordt ook geïnactiveerd door fosforylering van het nucleaire exportsignaal (NES) van cycline B1. De regulatoren van deze fosforyleringsplaatsen zijn nog grotendeels onbekend, maar er zijn verschillende factoren geïdentificeerd, waaronder extracellulaire signaalgereguleerde kinasen (ERKs), PLK1 en CDK1 zelf. Bij het bereiken van een bepaald drempelniveau van fosforylering is de translocatie van cycline B1 / CDK1 naar de kern extreem snel.Eenmaal in de kern fosforyleert cycline B1 / CDK1 veel doelen ter voorbereiding op mitose, waaronder histon H1, nucleaire lamines, centrosomale eiwitten en microtubule-geassocieerde eiwitten (MAPs).
De subcellulaire lokalisatie van cdc25 verschuift ook van het cytosol naar de kern tijdens profase. Dit wordt bereikt door verwijdering van nucleaire lokalisatiesequentie (NLS) -verblindende fosfaten en fosforylering van het nucleaire exportsignaal. Aangenomen wordt dat het gelijktijdige transport van cdc25 en cycline-B1 / CDK1 naar de kern de switch-achtige aard van de overgang versterkt door de effectieve concentraties van de eiwitten te verhogen.