Det næste trin var at rekruttere kvinder, der var villige til at bidrage med æg til kloningsproceduren og også indsamle celler fra enkeltpersoner, der skal klones (donorerne). Kloningsprocessen ser simpel ud, men succes afhænger af mange små faktorer, hvoraf nogle vi forstår endnu ikke. I den grundlæggende nukleare overførselsteknik bruger forskere en ekstremt fin nål til at suge det genetiske materiale fra et modent æg. De injicerer derefter kernen i donorcellen (eller nogle gange en hel celle) i det æggelukkede æg og inkuberes det under særlige forhold, der får det til at opdele og vokse.

Vi fandt kvinder villige til at bidrage med æg på et anonymt grundlag til brug i vores forskning ved at placere reklamer i publikationer i Boston-området. . Vi accepterede kun kvinder mellem 24 og 32 år, der havde mindst et barn. Interessant nok appellerede vores forslag til en anden delmængde af kvinder end dem, der ellers kunne bidrage med æg til infertile par til brug i in vitro-befrugtning. De kvinder, der reagerede på vores annoncer, var motiverede til at give deres æg til forskning, men mange ville ikke have været interesseret i at få deres æg brugt til at generere et barn, de aldrig ville se. (Donorerne blev rekrutteret, og æggene blev indsamlet af et hold ledet af Ann A. Kiessling-Cooper fra Duncan Holly Biomedical i Somerville, Mass. Kiessling var også en del af drøftelserne om etiske spørgsmål relateret til ægbidragere.)

Vi bad potentielle ægbidragere om at underkaste sig psykologiske og fysiske tests, herunder screening for smitsomme sygdomme, for at sikre, at kvinderne var raske, og at bidragende æg ikke ville påvirke dem negativt. Vi endte med 12 kvinder, der var gode kandidater til at bidrage med æg. I mellemtiden tog vi hudbiopsier fra flere andre anonyme personer for at isolere celler kaldet fibroblaster til brug i kloningsproceduren. Vores gruppe af fibroblastdonorer inkluderer mennesker i forskellige aldre, der generelt er sunde eller har en lidelse som diabetes eller rygmarvsskade, hvilke mennesker der sandsynligvis vil have gavn af terapeutisk kloning.

Vores første kloningsforsøg fandt sted i juli sidste år . Tidspunktet for hvert forsøg var afhængig af menstruationscyklussen hos de kvinder, der bidrog med æg; donorerne var nødt til at tage hormoninjektioner i flere dage, så de ovulerede 10 æg på én gang i stedet for den normale eller to.

Vi havde et glimt af succes i den tredje forsøgscyklus, da kerne af en injiceret fibroblast syntes at dele sig, men den spaltede aldrig for at danne to forskellige celler. Så i den næste cyklus besluttede vi at tage tacklen, der blev brugt af Teruhiko Wakayama og hans kolleger, forskerne, der skabte de første klonede mus i 1998. (Wakayama var dengang ved University of Hawaii og er nu på Advanced Cell Technology.) Selvom vi injiceret nogle af æggene med kerner fra hudfibroblaster som sædvanligt, injicerede vi andre med æggestokkeceller kaldet cumulusceller, der plejer at udvikle æg i æggestokken, og som kan findes stadig klæbe til æg efter ægløsning. Cumulus celler er så små, at de kan injiceres hele. I sidste ende tog det i alt 71 æg fra syv frivillige, før vi kunne generere vores første klonede tidlige embryo. Af de otte æg, vi injicerede med cumulusceller, blev to delt til at danne tidlige embryoner af fire celler, og et udviklede sig til mindst seks celler, før væksten stoppede.

Parthenogenese

VI SØGGES OGSÅ FOR AT BESTEMme vi kunne få menneskelige æg til at opdele sig i tidlige embryoner uden at blive befrugtet af en sæd eller blive enucleated og injiceret med en donorcelle. Selvom modne æg og sæd normalt kun har halvdelen af det genetiske materiale af en typisk kropscelle, for at forhindre et embryo i at have et dobbelt sæt gener efter undfangelsen, halverer æg deres genetiske komplement relativt sent i deres modningscyklus. Hvis de er aktiveret inden dette stadium, bevarer de stadig et komplet sæt gener.

Stamceller afledt af sådanne parthenogenetisk aktiverede celler ville sandsynligvis ikke blive afvist efter transplantation, fordi de ville være meget lig patientens egne celler og ikke ville producere mange molekyler, der ville være ukendte for personens immunsystem. (De ville ikke være identiske med individets celler på grund af det genblanding, der altid forekommer under dannelsen af æg og sæd.) Sådanne celler kan også skabe færre moralske dilemmaer for nogle mennesker end stamceller, der stammer fra klonede tidlige embryoner.

Under et scenarie kan en kvinde med hjertesygdomme få sine egne æg samlet og aktiveret i laboratoriet for at give blastocyster. Forskere kunne derefter bruge kombinationer af vækstfaktorer til at lokke stamceller isoleret fra blastocysterne til at blive hjertemuskelceller, der voksede i laboratorieretter, der kunne implanteres tilbage i kvinden for at lappe et sygt område af hjertet. Brug af en lignende teknik, kaldet androgenese, til at skabe stamceller til behandling af en mand ville være vanskeligere. Men det kan involvere overførsel af to kerner fra mandens sæd til et bidraget æg, der var blevet fjernet fra dets kerne.

Forskere har tidligere rapporteret, at de fik æg fra mus og kaniner til at opdele sig i embryoner ved at udsætte dem for forskellige kemikalier eller fysiske stimuli såsom elektrisk stød. Så tidligt som i 1983 demonstrerede Elizabeth J. Robertson, som nu er ved Harvard University, at stamceller isoleret fra parthenogenetiske musembryoer kunne danne en række forskellige væv, herunder nerve og muskler.

I vores parthenogeneseeksperimenter, vi udsatte 22 æg for kemikalier, der ændrede koncentrationen af ladede atomer kaldet ioner inde i cellerne. Efter fem dages dyrkning i dyrkningsretter havde seks æg udviklet sig til hvad der syntes at være blastocyster, men indeholdt ikke såkaldt den såkaldte indre cellemasse, der giver stamceller.

Hvorfor vi gjorde det

VI ER GLÆDENDE FOR DAGEN, når vi vil være i stand til at tilbyde terapeutisk kloning eller celleterapi som følge af parthenogenese til syge patienter. I øjeblikket er vores indsats fokuseret på sygdomme i nervesystemet og det kardiovaskulære system og på diabetes, autoimmune lidelser og sygdomme, der involverer blod og knoglemarv.

Når vi først er i stand til at udlede nerveceller fra klonede embryoner, håber vi ikke kun at helbrede beskadigede rygmarv, men at behandle hjernesygdomme som Parkinsons sygdom, hvor død af hjerneceller, der danner et stof kaldet dopamin fører til ukontrollerbar rysten og lammelse. Alzheimers sygdom, slagtilfælde og epilepsymight giver også sådan en tilgang. svigt, arytmier og hjertevæv arret af hjerteanfald.

En potentielt endnu mere interessant applikation kan involvere tilskyndelse til klonede stamceller til at differentiere sig til celler i blodet og knoglemarven. Autoimmune lidelser som multipel sklerose og reumatoid arthritis opstår, når hvide blodlegemer i immunsystemet, som opstår fra knoglemarven, angriber kroppens eget væv. Foreløbige undersøgelser har vist, at kræftpatienter, der også havde autoimmune sygdomme, fik lindring fra autoimmune symptomer, efter at de fik knoglemarvstransplantationer for at erstatte deres egen marv, der var blevet dræbt af højdosis kemoterapi til behandling af kræften. Infusioner af bloddannende eller hæmatopoietiske, klonede stamceller kan “genstarte” immunsystemet hos mennesker med autoimmune sygdomme.

Men er klonede celler eller dem, der genereres gennem parthenogenese, normale? Kun kliniske forsøg med cellerne viser i sidste ende, om sådanne celler er sikre nok til rutinemæssig brug hos patienter, men vores undersøgelser af klonede dyr har vist, at kloner er sunde. I udgaven af Science den 30. november 2001 rapporterede vi om vores succes hidtil med kloning af kvæg. Ud af 30 klonede kvæg døde seks kort efter fødslen, men resten har haft normale resultater ved fysiske undersøgelser, og test af deres immunforsvar viser, at de ikke adskiller sig fra almindeligt kvæg. To af køerne har endda født sunde kalve.

Kloningsprocessen ser også ud til at nulstille “aldringsuret” i klonede celler, så cellerne på nogle måder ser yngre ud end cellerne, hvorfra de blev klonet. I 2000 rapporterede vi, at telomerhætterne ved enderne af kromosomer fra klonede kalve er lige så lange som dem fra kontrolkalve. Telomerer forkorter eller beskadiges normalt, når en organisme ældes. Terapeutisk kloning kan give “unge” celler til en aldrende befolkning.

En rapport i juli sidste år af Rudolf Jaenisch fra Whitehead Institute for Biomedical Research i Cambridge, Mass., Og hans kolleger fik stor opmærksomhed, fordi den fandt det -kaldte imprintingsfejl i klonede mus. Imprinting er en type stempel, der placeres på mange gener i pattedyr, der ændrer, hvordan generne tændes eller slukkes, afhængigt af om generne arves fra moderen eller faderen. Imprintingsprogrammet er “nulstillet” generelt under embryonal udvikling.

Selvom imprinting ser ud til at spille en vigtig rolle hos mus, ved ingen endnu, hvor vigtigt fænomenet er for mennesker.Derudover undersøgte Jaenisch og hans kolleger ikke mus klonet fra celler taget fra legemsene hos voksne, såsom fibroblaster eller cumulusceller. I stedet undersøgte de mus klonet fra embryonale celler, hvilket kunne forventes at være mere variabelt. Undersøgelser, der viser, at imprinting er normalt hos mus klonet fra voksne celler, er i øjeblikket i presse og bør offentliggøres i den videnskabelige litteratur inden for flere måneder.

I mellemtiden fortsætter vi vores terapeutiske kloningseksperimenter for at generere klonede eller parthenogenetisk producerede humane embryoner, der vil give stamceller. Forskere er kun begyndt at udnytte denne vigtige ressource.

FORfatterne:

JOSE B. CIBELLI, ROBERT P. LANZA og MICHAEL D. WEST er vicepræsident for forskning, vicepræsident for medicinsk og videnskabelig udvikling og henholdsvis præsident og administrerende direktør for Advanced Cell Technology, et privatejet bioteknologiselskab i Worcester, Mass. Cibelli modtog sin DVM fra universitetet i La Plata i Argentina og hans ph.d. fra University of Massachusetts i Amherst. Hans forskning førte til oprettelsen af de første klonede genetisk modificerede kalve i 1998. Lanza har en M.D. fra University of Pennsylvania. Han er en tidligere Fulbright-lærd og er forfatter eller redaktør af adskillige populære og videnskabelige bøger, herunder teksten Principles of Tissue Engineering. West har en ph.d. fraBaylor College of Medicine og er især interesseret i aldring og stamceller. Fra 1990 til 1998 var han grundlægger, direktør og vicepræsident for Geron Corporation i Menlo Park, Californien, hvor han initierede og administrerede forskningsprogrammer inden for telomererbiologi (enderne af kromosomer, der krymper under aldring) og bestræbelserne på at udlede humane embryonale stamceller. Carol Ezzell er en personaleforfatter og redaktør.

MERE AT UDFORSKE:

Udsigter til brug af nuklear overførsel ved human transplantation. Robert P. Lanza, Jose B. Cibelli og Michael D West in NatureBiotechnology, bind. 17, nr. 12, side 11711174; December 1999.

Den etiske gyldighed ved anvendelse af nuklear overførsel til humantransplantation. Robert P. Lanza et al. i Journal of the American Medical Association, bind. 284, nr. 24; 27. december 2000.

Debatter om menneskelig embryoforskning: Bioetik i kontroversens hvirvel. Ronald M. Green. Oxford University Press, 2001.

Den fulde tekst i vores artikel i e-biomed: The Journal of Regenerative Medicine kan ses på www.liebertpub.com/ebi