Neste trinn var å rekruttere kvinner som er villige til å bidra med egg som skal brukes i kloningsprosedyren, og også samle celler fra individer som skal klones (giverne). Kloningsprosessen virker enkel, men suksess avhenger av mange små faktorer, hvorav noen vi forstår ikke. det under spesielle forhold som får det til å dele seg og vokse.

Vi fant kvinner villige til å bidra med egg på anonymt grunnlag for bruk i vår forskning ved å plassere annonser i publikasjoner i Boston-området. . Vi aksepterte bare kvinner mellom 24 og 32 år som hadde minst ett barn. Interessant, vårt forslag appellerte til en annen undergruppe av kvinner enn de som ellers kan bidra med egg til infertile par for bruk i in vitro befruktning. Kvinnene som svarte på annonsene våre var motiverte til å gi eggene sine til forskning, men mange hadde ikke vært interessert i å bruke eggene til å generere et barn de aldri ville se. (Donorene ble rekruttert og eggene ble samlet inn av et team ledet av Ann A. Kiessling-Cooper fra Duncan Holly Biomedical i Somerville, Mass. Kiessling var også en del av diskusjonen om etiske spørsmål knyttet til eggbidragsyterne.)

Vi ba potensielle eggbidragere om å underkaste seg psykologiske og fysiske tester, inkludert screening for smittsomme sykdommer, for å sikre at kvinnene var sunne og at bidragende egg ikke ville påvirke dem negativt. Vi endte opp med 12 kvinner som var gode kandidater til å bidra med egg. I mellomtiden tok vi hudbiopsier fra flere andre anonyme individer for å isolere celler kalt fibroblaster for bruk i kloningsprosedyren. Vår gruppe av fibroblastgivere inkluderer mennesker i varierende alder som generelt er sunne eller som har en lidelse som diabetes eller ryggmargsskade, de slags mennesker som sannsynligvis vil ha nytte av terapeutisk kloning.

Vårt første kloningsforsøk skjedde i juli i fjor. . Tidspunktet for hvert forsøk var avhengig av menstruasjonssyklusene til kvinnene som bidro med egg; giverne måtte ta hormoninjeksjoner i flere dager, slik at de eggla 10 eller så egg på en gang i stedet for den normale eller to.

Vi hadde et glimt av suksess i den tredje syklusen av forsøk da kjernen til en injisert fibroblast så ut til å dele seg, men den spaltet aldri for å danne to forskjellige celler. Så i neste syklus bestemte vi oss for å ta takken som ble brukt av Teruhiko Wakayama og hans kolleger, forskerne som skapte de første klonede musene i 1998. (Wakayama var da ved University of Hawaii og er nå på Advanced Cell Technology.) Selv om vi injiserte noen av eggene med kjerner fra hudfibroblaster som vanlig, injiserte vi andre med eggstokkceller kalt cumulusceller som vanligvis pleier å utvikle egg i eggstokken, og som kan bli funnet fremdeles klamrer seg til egg etter eggløsning. Cumulusceller er så små at de kan injiseres hele. Til slutt tok det til sammen 71 egg fra syv frivillige før vi kunne generere vårt første klonede tidlige embryo. Av de åtte eggene vi injiserte med cumulusceller, ble to delt for å danne tidlige embryoer med fire celler, og ett utviklet seg til minst seks celler før veksten stoppet. vi kunne få menneskelige egg til å dele seg i tidlige embryoer uten å bli befruktet av en sædceller eller bli enucleated og injisert med en donorcelle. Selv om modne egg og sæd normalt bare har halvparten av det genetiske materialet til en typisk kroppscelle, for å forhindre at et foster har et dobbelt sett med gener etter unnfangelsen, halverer egg det genetiske komplementet relativt sent i modningssyklusen. Hvis de er aktivert før det stadiet, beholder de fortsatt et komplett sett med gener.

Stamceller avledet fra slike parthenogenetisk aktiverte celler ville neppe bli avvist etter transplantasjon fordi de ville være veldig lik pasientens egne celler og ikke ville produsere mange molekyler som ville være ukjente for personens immunsystem. (De ville ikke være identiske med individcellene på grunn av genstokkingen som alltid forekommer under dannelsen av egg og sæd.) Slike celler kan også gi færre moralske dilemmaer for noen mennesker enn stamceller som kommer fra klonede tidlige embryoer.

Under ett scenario kan en kvinne med hjertesykdom få sine egne egg samlet og aktivert i laboratoriet for å gi blastocyster. Forskere kunne da bruke kombinasjoner av vekstfaktorer for å lokke stamceller isolert fra blastocystene for å bli hjertemuskelceller som vokser i laboratorieretter som kan implanteres tilbake i kvinnen for å lappe et sykt område av hjertet. Å bruke en lignende teknikk, kalt androgenese, for å lage stamceller for å behandle en mann ville være vanskeligere. Men det kan innebære overføring av to kjerner fra mansædet til et egg som har blitt fjernet fra kjernen.

Forskere har tidligere rapportert å ha bedt egg fra mus og kaniner om å dele seg i embryoer ved å utsette dem for forskjellige kjemikalier eller fysiske stimuli som et elektrisk støt. Så tidlig som 1983 demonstrerte Elizabeth J. Robertson, som nå er ved Harvard University, at stamceller isolert fra parthenogenetiske musembryoer kunne danne en rekke vev, inkludert nerve og muskler.

I parthenogeneseeksperimentene våre, vi utsatte 22 egg for kjemikalier som endret konsentrasjonen av ladede atomer kalt ioner i cellene. Etter fem dager med dyrking av kulturretter hadde seks egg utviklet seg til å synes å være blastocyster, men inneholdt ikke såkalt den såkalte indre cellemassen som gir stamceller.

Why We Did It

Vi er glade for dagen når vi vil kunne tilby terapeutisk kloning eller celleterapi som oppstår fra partenogenese til syke pasienter. Foreløpig er vår innsats fokusert på sykdommer i nervesystemet og kardiovaskulærsystemet, og på diabetes, autoimmune lidelser og sykdommer som involverer blod og benmarg.

Når vi er i stand til å hente nerveceller fra klonede embryoer, håper vi ikke bare å helbrede ødelagte ryggmarger, men å behandle hjernesykdommer som Parkinsons sykdom, der død av hjerneceller som lager et stoff dopamin fører til ukontrollerbar skjelving og lammelse. Alzheimers sykdom, hjerneslag og epilepsymight gir også en slik tilnærming. svikt, arytmier og hjertevev arret av hjerteinfarkt.

En potensielt enda mer interessant applikasjon kan innebære å få klonede stamceller til å skille seg ut i celler i blodet og benmargen. Autoimmune lidelser som multippel sklerose og revmatoid artritt oppstår når hvite blodlegemer i immunsystemet, som oppstår fra beinmargen, angriper kroppens eget vev. Foreløpige studier har vist at kreftpasienter som også hadde autoimmune sykdommer fikk lindring fra autoimmune symptomer etter at de fikk benmargstransplantasjoner for å erstatte sin egen marg som hadde blitt drept av høydose cellegift for å behandle kreften. Infusjoner av bloddannende eller hematopoietiske, klonede stamceller kan «starte» immunforsvaret til mennesker med autoimmune sykdommer.

Men er klonede celler eller de som genereres gjennom parthenogenese normalt? Bare kliniske tester av cellene vil til slutt vise om slike celler er trygge nok til rutinemessig bruk hos pasienter, men våre studier av klonede dyr har vist at kloner er sunne. I utgaven av Science, 30. november 2001, rapporterte vi om vår suksess hittil med kloning av storfe. Av 30 klonede storfe døde seks kort tid etter fødselen, men resten har hatt normale resultater på fysiske undersøkelser, og tester av immunforsvaret viser at de ikke skiller seg fra vanlig storfe. To av kyrne har til og med født sunne kalver.

Kloningsprosessen ser også ut til å tilbakestille «aldringsklokken» i klonede celler, slik at cellene ser yngre ut på noen måter enn cellene som de ble klonet. I 2000 rapporterte vi at telomerene på endene av kromosomer fra klonede kalver er like lange som de fra kontrollkalver. Telomerer forkorter normalt eller blir skadet etter hvert som en organisme eldes. Terapeutisk kloning kan gi «unge» celler for en aldrende befolkning.

En rapport i juli i fjor av Rudolf Jaenisch fra Whitehead Institute for Biomedical Research i Cambridge, Mass., Og hans kolleger fikk stor oppmerksomhet fordi den fant det -kalt påtrykksfeil hos klonede mus. Imprinting er en type stempel som er plassert på mange gener i pattedyr som endrer hvordan genene slås på eller av, avhengig av om genene arves fra moren eller faren. Påtrykkingsprogrammet er vanligvis «tilbakestilt» under embryonal utvikling.

Selv om det ser ut til at påtrykk spiller en viktig rolle hos mus, vet ingen ennå hvor viktig fenomenet er for mennesker.I tillegg studerte Jaenisch og hans medarbeidere ikke mus klonet fra celler hentet fra kroppene til voksne, slik som fibroblaster eller cumulusceller. I stedet undersøkte de mus klonet fra embryonale celler, noe som kan forventes å være mer varierende. Studier som viser at innprenting er normalt hos mus klonet fra voksne celler, er for tiden i trykk og bør publiseres i den vitenskapelige litteraturen innen flere måneder.

I mellomtiden fortsetter vi våre terapeutiske kloningseksperimenter for å generere klonede eller parthenogenetisk produserte humane embryoer som vil gi stamceller. Forskere har bare begynt å ta i bruk denne viktige ressursen.

FORfatterne:

JOSE B. CIBELLI, ROBERT P. LANZA og MICHAEL D. WEST er visepresident for forskning, visepresident for medisinsk og vitenskapelig utvikling, og henholdsvis president og administrerende direktør for Advanced Cell Technology, et privateid bioteknologiselskap i Worcester, Mass. Cibelli mottok sin DVM fra University of La Plata i Argentina og doktorgraden. fra University of Massachusetts i Amherst. Hans forskning førte til opprettelsen av de første klonede genetisk modifiserte kalvene i 1998. Lanza har en doktorgrad fra University of Pennsylvania. Han er tidligere Fulbright-lærd og er forfatter eller redaktør av mange populære og vitenskapelige bøker, inkludert teksten Principles of Tissue Engineering. West har en doktorgrad fra Baylor College of Medicine og er spesielt interessert i aldring og stamceller. Fra 1990 til 1998 var han grunnlegger, direktør og visepresident for Geron Corporation i Menlo Park, California, hvor han initierte og administrerte forskningsprogrammer innen telomerers biologi (endene på kromosomer, som krymper under aldring) og arbeidet med å utlede menneskelige embryonale stamceller. Carol Ezzell er personalforfatter og redaktør.

MER Å UTFORSKE:

Utsiktene for bruk av atomoverføring ved menneskelig transplantasjon. Robert P. Lanza, Jose B. Cibelli og Michael D West in NatureBiotechnology, Vol. 17, nr. 12, side 11711174; Desember 1999.

Den etiske gyldigheten av å bruke atomoverføring i humantransplantasjon. Robert P. Lanza et al. i Journal of the American Medical Association, Vol. 284, nr. 24; 27. desember 2000.

Human Embryo Research Debates: Bioethics in the Vortex of Controversy. Ronald M. Green. Oxford University Press, 2001.

Fullteksten til artikkelen vår i e-biomed: The Journal of Regenerative Medicine kan sees på www.liebertpub.com/ebi