Fase G2 (Italiano)

Lingresso mitotico è determinato da un livello di soglia del complesso ciclina-B1 / CDK1 attivo, anche noto come ciclina-B1 / Cdc2 o fattore di promozione della maturazione (MPF). La ciclina-B1 / CDK1 attiva innesca azioni irreversibili nella mitosi precoce, tra cui la separazione dei centrosomi, la rottura dellinvolucro nucleare e lassemblaggio del fuso. Nei vertebrati, ci sono cinque isoforme di ciclina B (B1, B2, B3, B4 e B5), ma il ruolo specifico di ciascuna di queste isoforme nella regolazione dellingresso mitotico non è ancora chiaro. È noto che la ciclina B1 può compensare la perdita sia della ciclina B2 (e viceversa nella Drosophila). Saccharomyces cerevisiae contiene sei cicline di tipo B (Clb1-6), di cui Clb2 è la più essenziale per la funzione. In entrambi i vertebrati e in S. cerevisiae, si ipotizza che la presenza di più cicline di tipo B consenta a cicline diverse di regolare diverse porzioni della transizione G2 / M, rendendo la transizione robusta alle perturbazioni.

le discussioni si concentreranno sullattivazione spaziale e temporale della ciclina B1 / CDK nelle cellule di mammifero, ma percorsi simili sono applicabili sia in altri metazoi che in S. cerevisiae.

Sintesi e degradazione della ciclina B1Modifica

Cyclin B1 sono soppressi durante le fasi G1 e S dal complesso di promozione dellanafase (APC), una ubiquitina ligasi E3 che prende di mira la ciclina B1 per la proteolisi. La trascrizione inizia alla fine della fase S dopo la replicazione del DNA, in risposta alla fosforilazione di fattori di trascrizione come NF-Y, FoxM1 e B-Myb da parte dei complessi ciclina-CDK G1 e G1 / S a monte.

Regolamento di attività della ciclina-B1 / CDK1 e chinasi Myt1. Wee1 è localizzato principalmente nel nucleo e agisce sul sito Tyr15, mentre Myt1 è localizzato sulla superficie esterna del pronto soccorso e agisce prevalentemente sul sito Thr14.

Gli effetti di Wee1 e Myt1 sono contrastati dalle fosfatasi in la famiglia cdc25, che rimuove i fosfati inibitori su CDK1 e quindi converte il complesso ciclina B1-CDK1 nella sua forma completamente attivata, MPF.

Questo diagramma illustra i cicli di feedback alla base della transizione G2 / M. Cyclin-B1 / CDK1 attiva Plk e inattiva Wee1 e Myt1. Plk attivato attiva cdc25. Lattivazione di Cdc25 e linattivazione di Wee1 / Myt1 portano a unulteriore attivazione di Cyclin-B1 / CDK1. Viene anche mostrato il ruolo putativo della ciclina-A / CDK2 e del Cdc25A come attivatori iniziali del ciclo di feedback, discusso in una sezione successiva.

CiclinaB1-CDK1 attiva fosforila e modula lattività delle isoforme Wee1 e Cdc25 A e C. In particolare, la fosforilazione di CDK1 inibisce lattività della chinasi Wee1, attiva lattività della fosfatasi Cdc25C tramite lattivazione della chinasi intermedia PLK1 e stabilizza Cdc25A. Pertanto, CDK1 forma un ciclo di feedback positivo con Cdc25 e un doppio ciclo di feedback negativo con Wee1 (essenzialmente un ciclo di feedback positivo netto).

Feedback positivo e attivazione simile a un interruttoreEdit

Questi circuiti di feedback positivi codificano un interruttore bistabile isteretico nellattività CDK1 rispetto ai livelli di ciclina B1 (vedi figura). Questo interruttore è caratterizzato da due distinti equilibri stabili su una regione bistabile di concentrazioni di ciclina B1. Un equilibrio corrisponde allinterfase ed è caratterizzato dallinattività di Cyclin-B1 / CDK1 e Cdc25 e da un alto livello di attività Wee1 e Myt1. Laltro equilibrio corrisponde alla fase M ed è caratterizzato da unelevata attività di Cyclin-B1 / CDK1 e Cdc25 e da una bassa attività Wee1 e Myt1. Allinterno dellintervallo di bistabilità, lo stato di una cellula dipende dal fatto che fosse precedentemente in interfase o in fase M: la concentrazione soglia per entrare nella fase M è superiore alla concentrazione minima che sosterrà lattività della fase M una volta che una cellula è già uscita dallinterfase .

Gli scienziati hanno convalidato sia teoricamente che empiricamente la natura bistabile della transizione G2 / M. Il modello Novak-Tyson mostra che le equazioni differenziali che modellano il ciclo di feedback cyclin-B / CDK1-cdc25-Wee1-Myt1 ammettono due equilibri stabili su un intervallo di concentrazioni di ciclina-B. Sperimentalmente, la bistabilità è stata convalidata bloccando la sintesi endogena della ciclina B1 e titolando le cellule in interfase e in fase M con concentrazioni variabili di ciclina B1 non degradabile.Questi esperimenti mostrano che la concentrazione di soglia per entrare nella fase M è maggiore della soglia per uscire dalla fase M: la rottura dellinvolucro nucleare si verifica tra 32-40 nm di ciclina-B1 per le cellule che escono dallinterfase, mentre il nucleo rimane disintegrato a concentrazioni superiori 16-24 nm nelle cellule già in fase M.

Questo interruttore isteretico bistabile è fisiologicamente necessario per almeno tre ragioni. In primo luogo, la transizione G2 / M segnala linizio di diversi eventi, come la condensazione cromosomica e la rottura dellinvolucro nucleare, che modificano notevolmente la morfologia della cellula e sono vitali solo nelle cellule in divisione. È quindi essenziale che lattivazione della ciclina-B1 / CDK1 avvenga in modo simile a un interruttore; cioè, le cellule dovrebbero stabilirsi rapidamente in uno stato di fase M discreto dopo la transizione e non dovrebbero persistere in un continuum di stati intermedi (ad esempio, con un inviluppo nucleare parzialmente decomposto). Questo requisito è soddisfatto dalla netta discontinuità che separa i livelli di equilibrio interfase e fase M dellattività CDK1; quando la concentrazione di ciclina B aumenta oltre la soglia di attivazione, la cellula passa rapidamente allequilibrio della fase M.

In secondo luogo, è anche fondamentale che la transizione G2 / M avvenga in modo unidirezionale, o solo una volta per cellula ciclo I sistemi biologici sono intrinsecamente rumorosi e piccole fluttuazioni nelle concentrazioni di ciclina B1 vicino alla soglia per la transizione G2 / M non dovrebbero causare il passaggio della cellula avanti e indietro tra gli stati interfase e M-fase. Ciò è garantito dalla natura bistabile dellinterruttore: dopo la transizione della cellula allo stato di fase M, piccole diminuzioni nella concentrazione di ciclina B non fanno tornare la cellula allinterfase.

Infine, la continuazione del ciclo cellulare richiede oscillazioni persistenti nellattività della ciclina-B / CDK1 mentre la cellula ei suoi discendenti entrano e escono dalla fase M. Il feedback negativo fornisce un elemento essenziale di questa oscillazione a lungo termine: la ciclina-B / CDK attiva lAPC / C, che causa la degradazione della ciclina-B dalla metafase in poi, riportando CDK1 al suo stato inattivo. Tuttavia, semplici circuiti di feedback negativi portano a oscillazioni smorzate che alla fine si stabilizzano su uno stato stazionario. I modelli cinetici mostrano che i cicli di feedback negativi accoppiati a motivi di feedback positivi bistabili possono portare a oscillazioni persistenti e non smorzate (vedi oscillatore di rilassamento) del tipo richiesto per il ciclo cellulare a lungo termine.

Feedback positivoModifica

Il ciclo di feedback positivo menzionato sopra, in cui cyclin-B1 / CDK1 promuove la propria attivazione inibendo Wee1 e Myst1 e attivando cdc25, non include intrinsecamente un trigger ” “Meccanismo per avviare il ciclo di feedback. Recentemente, sono emerse prove che suggeriscono un ruolo più importante per i complessi ciclina A2 / CDK nella regolazione dellinizio di questo interruttore. Lattività della ciclina A2 / CDK2 inizia nella fase iniziale S e aumenta durante G2. Cdc25B è stata dimostrato di defosforilare Tyr15 su CDK2 in G2 da inizio a metà in un modo simile al meccanismo CDK1 sopra menzionato. La sottoregolazione della ciclina A2 nelle cellule U2OS ritarda lattivazione di ciclina-B1 / CDK1 aumentando lattività di Wee1 e abbassando lattività di Plk1 e Cdc25C. Tuttavia, I complessi della ciclina A2 / CDK non funzionano strettamente come attivatori della ciclina B1 / CDK1 in G2, poiché è stato dimostrato che CDK2 è richiesto per lattivazione dellattività del checkpoint G2 indipendente da p53, forse attraverso una fosforilazione stabilizzante su C dc6. Le cellule CDK2 – / – hanno anche livelli eccessivamente alti di Cdc25A. È stato anche dimostrato che la ciclina A2 / CDK1 media la distruzione proteasomale di Cdc25B. Questi percorsi sono spesso deregolamentati nel cancro.

Regolazione spazialeModifica

Oltre agli aspetti bistabili e isteretici dellattivazione della ciclina B1-CDK1, anche la regolazione della localizzazione delle proteine subcellulari contribuisce al G2 / Transizione M. La ciclina inattiva B1-CDK1 si accumula nel citoplasma, inizia ad essere attivata dal citoplasma cdc25 e quindi viene rapidamente sequestrata nel nucleo durante la profase (poiché viene ulteriormente attivata). Nei mammiferi, la traslocazione della ciclina B1 / CDK1 nel nucleo viene attivata dalla fosforilazione di cinque siti di serina sul sito di ritenzione citoplasmatica (CRS) della ciclina B1: S116, S26, S128, S133 e S147. In Xenopus laevis, la ciclina B1 ne contiene quattro analoghi siti di fosforilazione della serina CRS (S94, S96, S101 e S113) che indicano che questo meccanismo è altamente conservato. Lesportazione nucleare è anche inattivata dalla fosforilazione del segnale di esportazione nucleare della ciclina B1 (NES). I regolatori di questi siti di fosforilazione sono ancora in gran parte sconosciuti, ma sono stati identificati diversi fattori, tra cui le chinasi regolate dal segnale extracellulari (ERK), PLK1 e CDK1 stesso. Al raggiungimento di un certo livello di soglia di fosforilazione, la traslocazione della ciclina B1 / CDK1 nel nucleo è estremamente rapida.Una volta nel nucleo, la ciclina B1 / CDK1 fosforila molti bersagli in preparazione alla mitosi, inclusi listone H1, le lamine nucleari, le proteine centrosomali e le proteine associate ai microtubuli (MAP).

Anche la localizzazione subcellulare di cdc25 si sposta da il citosol al nucleo durante la profase. Ciò si ottiene tramite la rimozione dei fosfati oscuranti della sequenza di localizzazione nucleare (NLS) e la fosforilazione del segnale di esportazione nucleare. Si ritiene che il trasporto simultaneo di cdc25 e ciclina-B1 / CDK1 nel nucleo amplifichi la natura simile a un interruttore della transizione aumentando le concentrazioni effettive delle proteine.