Fáze G2

Mitotický vstup je určen prahovou úrovní aktivního komplexu cyklin-B1 / CDK1, také známý jako cyklin-B1 / Cdc2 nebo faktor podporující zrání (MPF). Aktivní cyklin-B1 / CDK1 spouští nevratné akce v časné mitóze, včetně separace centrosomů, rozpadu jaderného obalu a sestavení vřetena. U obratlovců existuje pět izoforem cyklinu B (B1, B2, B3, B4 a B5), ale specifická role každé z těchto izoforem při regulaci mitotického vstupu je stále nejasná. Je známo, že cyklin B1 může kompenzovat ztrátu jak cyklinu B2 (a naopak u Drosophily). Saccharomyces cerevisiae obsahuje šest cyklinů typu B (Clb1-6), přičemž Clb2 je pro funkci nejdůležitější. U obratlovců i u S. cerevisiae se spekuluje, že přítomnost více cyklinů typu B umožňuje různým cyklinům regulovat různé části přechodu G2 / M a zároveň přechod učinit robustním vůči poruchám.

Následné diskuse se zaměří na prostorovou a časovou aktivaci cyklinu B1 / CDK v buňkách savců, ale podobné cesty jsou použitelné jak u jiných metazoanů, tak u S. cerevisiae.

Syntéza a degradace cyklinu B1 Upravit

Cyklinu B1 jsou potlačovány v průběhu G1 a S fází komplexem podporujícím anafázu (APC), ubikvitinovou ligázou E3, která se zaměřuje na cyklin B1 kvůli proteolýze. Transkripce začíná na konci S fáze po replikaci DNA, v reakci na fosforylaci transkripčních faktorů, jako jsou NF-Y, FoxM1 a B-Myb, předřazenými komplexy G1 a G1 / S cyklin-CDK.

Regulace aktivity cyklinu-B1 / CDK1 Upravit

Zvýšené hladiny cyklinu B1 způsobují zvyšování hladin komplexů cyklinu B1-CDK1 v celém G2, ale komplex zůstává neaktivní před přechodem G2 / M kvůli inhibiční fosforylaci Wee1 a Myt1 kinázy. Wee1 je lokalizován primárně do jádra a působí na místo Tyr15, zatímco Myt1 je lokalizován na vnější povrch ER a působí převážně na místo Thr14.

Účinky Wee1 a Myt1 jsou potlačeny fosfatázami v rodina cdc25, která odstraňuje inhibiční fosfáty na CDK1 a tím převádí komplex cyklin B1-CDK1 na plně aktivovanou formu MPF.

Aktivní cyklinB1-CDK1 fosforyluje a moduluje aktivita Wee1 a izoforem Cdc25 A a C. Konkrétně fosforylace CDK1 inhibuje aktivitu kinázy Wee1, aktivuje aktivitu fosfatázy Cdc25C aktivací intermediární kinázy PLK1 a stabilizuje Cdc25A. CDK1 tedy vytváří smyčku pozitivní zpětné vazby s Cdc25 a dvojitou smyčku negativní zpětné vazby s Wee1 (v podstatě čistá smyčka pozitivní zpětné vazby).

Pozitivní zpětná vazba a aktivace podobná přepínačiEdit

Tyto smyčky pozitivní zpětné vazby kódují hysteretický bistabilní přepínač v aktivitě CDK1 ve srovnání s úrovněmi cyklinu B1 (viz obrázek). Tento přepínač je charakterizován dvěma odlišnými stabilními rovnováhami v bistabilní oblasti koncentrací cyklinu B1. Jedna rovnováha odpovídá mezifázi a vyznačuje se nečinností cyklin-B1 / CDK1 a Cdc25 a vysokou úrovní aktivity Wee1 a Myt1. Druhá rovnováha odpovídá M-fázi a je charakterizována vysokou aktivitou cyklin-B1 / CDK1 a Cdc25 a nízkou aktivitou Wee1 a Myt1. V rozsahu bistability závisí stav buňky na tom, zda byla dříve v mezifázi nebo ve fázi M: prahová koncentrace pro vstup do fáze M je vyšší než minimální koncentrace, která udrží aktivitu fáze M, jakmile již buňka opustila mezifázi .

Vědci teoreticky i empiricky potvrdili bistabilní povahu přechodu G2 / M. Model Novak-Tyson ukazuje, že diferenciální rovnice modelování zpětnovazební smyčky cyklin-B / CDK1-cdc25-Wee1-Myt1 připouštějí dvě stabilní rovnováhy v rozsahu koncentrací cyklin-B. Experimentálně byla bistabilita ověřena blokováním syntézy endogenního cyklinu B1 a titrací mezifázových a M-fázových buněk s různými koncentracemi nedegradovatelného cyklinu B1.Tyto experimenty ukazují, že prahová koncentrace pro vstup do M-fáze je vyšší než prahová hodnota pro opuštění M-fáze: k rozpadu jaderné obálky dochází mezi 32-40 nm cyklin-B1 u buněk opouštějících mezifázi, zatímco jádro zůstává rozpadlé při koncentracích nad 16-24 nm v buňkách již v M-fázi.

Tento bistabilní, hysteretický spínač je fyziologicky nezbytný alespoň ze tří důvodů. Za prvé, přechod G2 / M signalizuje zahájení několika událostí, jako je kondenzace chromozomů a rozpad jaderného obalu, které výrazně mění morfologii buňky a jsou životaschopné pouze v dělících se buňkách. Je proto nezbytné, aby aktivace cyklin-B1 / CDK1 proběhla způsobem podobným přepínači; to znamená, že buňky by se po přechodu měly rychle usadit do diskrétního stavu fáze M a neměly by přetrvávat v kontinuu přechodných stavů (např. s částečně rozloženým jaderným obalem). Tento požadavek je splněn ostrou diskontinuitou oddělující mezifázovou a M-fázovou rovnovážnou hladinu aktivity CDK1; jak se koncentrace cyklinu-B zvyšuje nad prahovou hodnotu pro aktivaci, buňka rychle přechází do rovnováhy fáze M.

Zadruhé je také důležité, aby k přechodu G2 / M došlo jednosměrně, nebo pouze jednou na buňku cyklus Biologické systémy jsou ze své podstaty hlučné a malé výkyvy v koncentracích cyklinu B1 blízko prahové hodnoty pro přechod G2 / M by neměly způsobit přepínání buňky tam a zpět mezi fázovými stavy a fázemi M. To je zajištěno bistabilní povahou přepínače: po přechodu buňky do stavu M fáze malé snížení koncentrace cyklinu B nezpůsobí, že se buňka přepne zpět na mezifázi.

Nakonec pokračování buněčného cyklu vyžaduje přetrvávající oscilace v aktivitě cyklin-B / CDK1 při přechodu buňky a jejích potomků dovnitř a ven z M-fáze. Negativní zpětná vazba poskytuje jeden podstatný prvek této dlouhodobé oscilace: cyklin-B / CDK aktivuje APC / C, což způsobuje degradaci cyklinu-B od metafáze a obnovuje CDK1 do neaktivního stavu. Jednoduché smyčky negativní zpětné vazby však vedou k tlumeným oscilacím, které se nakonec ustálí na ustáleném stavu. Kinetické modely ukazují, že smyčky negativní zpětné vazby spolu s bistabilními motivy pozitivní zpětné vazby mohou vést k trvalým, neutlumeným oscilacím (viz relaxační oscilátor), jaké jsou vyžadovány pro dlouhodobé cyklování buněk.

Pozitivní zpětná vazba

Výše uvedená smyčka pozitivní zpětné vazby, ve které cyklin-B1 / CDK1 podporuje svou vlastní aktivaci inhibicí Wee1 a Myst1 a aktivací cdc25, ve své podstatě neobsahuje „spouštěč“ „Mechanismus pro zahájení zpětnovazební smyčky. Nedávno se objevily důkazy naznačující důležitější roli komplexů cyklin A2 / CDK při regulaci iniciace tohoto přechodu. Aktivita cyklin A2 / CDK2 začíná v rané fázi S a zvyšuje se během G2. Cdc25B byl prokázáno, že defosforyluje Tyr15 na CDK2 v raném až středním G2 podobným způsobem jako výše uvedený mechanismus CDK1. Downregulace cyklinu A2 v buňkách U2OS zpomaluje aktivaci cyklinu-B1 / CDK1 zvýšením aktivity Wee1 a snížením aktivity Plk1 a Cdc25C. komplexy cyklinu A2 / CDK nefungují striktně jako aktivátory cyklinu B1 / CDK1 v G2, protože se ukázalo, že CDK2 je vyžadován pro aktivaci aktivity kontrolního bodu G2 nezávislé na p53, možná prostřednictvím stabilizující fosforylace na C dc6. Buňky CDK2 – / – také mají aberantně vysoké hladiny Cdc25A. Bylo také prokázáno, že cyklin A2 / CDK1 zprostředkovává proteazomální destrukci Cdc25B. Tyto cesty jsou u rakoviny často deregulované.

Prostorová regulace Upravit

Kromě bistabilních a hysteretických aspektů aktivace cyklinu B1-CDK1 přispívá k G2 / také lokalizace subcelulárního proteinu. M přechod. Neaktivní cyklin B1-CDK1 se hromadí v cytoplazmě, začíná se aktivovat cytoplazmatickým cdc25 a poté se během profázy rychle sekvestruje do jádra (protože se dále aktivuje). U savců je translokace cyklinu B1 / CDK1 do jádra aktivována fosforylací pěti serinových míst na cytoplazmatickém retenčním místě cyklinu B1 (CRS): S116, S26, S128, S133 a S147. U Xenopus laevis obsahuje cyklin B1 čtyři analogická místa fosforylace serinu CRS (S94, S96, S101 a S113), což naznačuje, že tento mechanismus je vysoce konzervativní. Jaderný export je také inaktivován fosforylací signálu nukleárního exportu (NES) cyklinu B1. Regulátory těchto fosforylačních míst jsou stále do značné míry neznámé, ale bylo identifikováno několik faktorů, včetně extracelulárních signálem regulovaných kináz (ERK), PLK1 a samotných CDK1. Po dosažení určité prahové úrovně fosforylace je translokace cyklinu Bl / CDK1 do jádra extrémně rychlá.Jakmile je v jádru, cyklin B1 / CDK1 fosforyluje mnoho cílů při přípravě na mitózu, včetně histonu H1, jaderných laminů, centrosomálních proteinů a proteinů asociovaných s mikrotubuly (MAP).

Subcelulární lokalizace cdc25 se také přesouvá z cytosol do jádra během profáze. Toho je dosaženo odstraněním fosfátů, které blokují nukleární lokalizační sekvenci (NLS), a fosforylací exportního jaderného signálu. Předpokládá se, že současný transport cdc25 a cyklinu-B1 / CDK1 do jádra zesiluje přechodovou povahu přechodu zvýšením účinných koncentrací proteinů.