Nästa steg var att rekrytera kvinnor som är villiga att bidra med ägg som ska användas i kloningsförfarandet och också samla in celler från individer som ska klonas (givarna). Kloningsprocessen verkar enkel men framgång beror på många små faktorer, varav några vi förstår ännu inte. I den grundläggande kärnöverföringstekniken använder forskare en extremt fin nål för att suga det genetiska materialet från ett moget ägg. De injicerar sedan kärnan i donatorcellen (eller ibland en hel cell) i det kärnformade ägget och inkuberar det under speciella förhållanden som föranleder det att dela sig och växa.

Vi hittade kvinnor som var villiga att bidra med ägg på anonym basis för användning i vår forskning genom att placera annonser i publikationer i Boston-området. . Vi accepterade bara kvinnor mellan 24 och 32 år som hade minst ett barn. Intressant är att vårt förslag vädjade till en annan delmängd av kvinnor än de som annars skulle kunna bidra med ägg till infertila par för användning vid in vitro-befruktning. Kvinnorna som svarade på våra annonser var motiverade att ge sina ägg för forskning, men många hade inte varit intresserade av att använda sina ägg för att generera ett barn de aldrig skulle se. (Givarna rekryterades och äggen samlades in av ett team ledt av Ann A. Kiessling-Cooper från Duncan Holly Biomedical i Somerville, Mass. Kiessling var också en del av överläggningarna om etiska frågor relaterade till äggbidragarna.)

Vi bad potentiella äggdrivande att underkasta sig psykologiska och fysiska tester, inklusive screening för smittsamma sjukdomar, för att säkerställa att kvinnorna var friska och att bidragande ägg inte skulle påverka dem negativt. Vi slutade med 12 kvinnor som var bra kandidater för att bidra med ägg. Under tiden tog vi hudbiopsier från flera andra anonyma individer för att isolera celler som kallas fibroblaster för användning i kloningsförfarandet. Vår grupp av fibroblastgivare inkluderar människor i olika åldrar som i allmänhet är friska eller som har en sjukdom som diabetes eller ryggmärgsskada. Den typ av människor som sannolikt kan dra nytta av terapeutisk kloning.

Vårt första kloningsförsök inträffade i juli förra året . Tidpunkten för varje försök berodde på menstruationscyklerna hos kvinnorna som bidrog med ägg; givarna var tvungna att ta hormoninjektioner i flera dagar så att de ägglossade 10 eller så ägg på en gång istället för den normala eller två.

Vi hade en glimt av framgång i den tredje cykeln av försök när kärnan i en injicerad fibroblast verkade dela sig, men den klyvde sig aldrig för att bilda två distinkta celler. Så i nästa cykel bestämde vi oss för att ta det tack som Teruhiko Wakayama och hans kollegor använde, forskarna som skapade de första klonade mössen 1998. (Wakayama var då vid University of Hawaii och är nu på Advanced Cell Technology.) Även om vi injicerade några av äggen med kärnor från hudfibroblaster som vanligt, injicerade vi andra med äggstocksceller som kallas cumulusceller som vanligtvis vårdar utvecklande ägg i äggstocken och som fortfarande kan fastna vid ägg efter ägglossningen. Cumulusceller är så små att de kan injiceras hela. Till slut tog det totalt 71 ägg från sju volontärer innan vi kunde generera vårt första klonade tidiga embryo. Av de åtta ägg som vi injicerade med cumulusceller delades två upp för att bilda tidiga embryon av fyra celler och ett utvecklades till åtminstone sex celler innan tillväxten stoppades. vi kunde få mänskliga ägg att dela sig i tidiga embryon utan att befruktas av en sperma eller bli kärnformade och injicerade med en donatorcell. Även om mogna ägg och spermier normalt bara har hälften av det genetiska materialet hos en typisk kroppscell, för att förhindra att ett embryo har en dubbel uppsättning gener efter befruktningen, halverar ägget sitt genetiska komplement relativt sent i mognadscykeln. Om de aktiveras före det steget behåller de fortfarande en hel uppsättning gener.

Stamceller härledda från sådana partenogenetiskt aktiverade celler skulle sannolikt inte avvisas efter transplantation eftersom de skulle likna en patients egna celler och inte skulle producera många molekyler som inte kände till personens immunsystem. (De skulle inte vara identiska med individens celler på grund av genblandningen som alltid sker under bildandet av ägg och spermier.) Sådana celler kan också ge upphov till färre moraliska dilemman för vissa människor än stamceller som härrör från klonade tidiga embryon.

Enligt ett scenario kan en kvinna med hjärtsjukdom få sina egna ägg samlade och aktiverade i laboratoriet för att ge blastocyster. Forskare kunde sedan använda kombinationer av tillväxtfaktorer för att locka stamceller isolerade från blastocysterna för att bli hjärtmuskelceller som växer i laboratorierätter som kan implanteras tillbaka i kvinnan för att lappa ett sjukt område i hjärtat. Att använda en liknande teknik, kallad androgenes, för att skapa stamceller för att behandla en man skulle vara svårare. Men det kan innebära att två kärnor överförs från mans spermier till ett bidragande ägg som hade tagits bort från sin kärna.

Forskare har tidigare rapporterat att de uppmanade ägg från möss och kaniner att dela sig i embryon genom att utsätta dem för olika kemikalier eller fysiska stimuli såsom en elektrisk stöt. Redan 1983 visade Elizabeth J. Robertson, som nu är vid Harvard University, att stamceller isolerade från parthenogenetiska musembryon kan bilda en mängd olika vävnader, inklusive nerv och muskler.

I våra parthenogenesexperiment, vi utsatte 22 ägg för kemikalier som förändrade koncentrationen av laddade atomer kallade joner inuti cellerna. Efter fem dagars odling i odlingsrätter hade sex ägg utvecklats till vad som tycktes vara blastocyster, men innehöll oklart den så kallade inre cellmassan som ger stamceller.

Varför vi gjorde det

VI ÄR ENGARE FÖR DAGEN när vi kommer att kunna erbjuda terapeutisk kloning eller cellterapi till följd av partenogenes till sjuka patienter. För närvarande fokuseras våra ansträngningar på sjukdomar i nervsystemet och hjärt-kärlsystemet och på diabetes, autoimmuna sjukdomar och sjukdomar som involverar blod och benmärg.

När vi väl kan ta nervceller från klonade embryon hoppas vi inte bara att läka skadade ryggmärgar utan att behandla hjärnsjukdomar som Parkinsons sjukdom, där hjärnceller dödar ett ämne som kallas dopamin leder till okontrollerbar skakningar och förlamning. Alzheimers sjukdom, stroke och epilepsymight ger också en sådan metod. svikt, arytmier och hjärtvävnad ärr av hjärtinfarkt.

En potentiellt ännu mer intressant applikation kan innebära att klonade stamceller uppmanas att differentiera sig till celler i blodet och benmärgen. Autoimmuna sjukdomar som multipel skleros och reumatoid artrit uppstår när vita blodkroppar i immunsystemet, som uppstår från benmärgen, attackerar kroppens egna vävnader. Preliminära studier har visat att cancerpatienter som också hade autoimmuna sjukdomar fick lindring från autoimmuna symtom efter att de fick benmärgstransplantationer för att ersätta sin egen märg som hade dödats av högdos kemoterapi för att behandla cancer. Infusioner av blodbildande eller hematopoetiska, klonade stamceller kan ”starta om” immunförsvaret hos personer med autoimmuna sjukdomar.

Men är klonade celler eller de som genereras genom parthenogenesnorm? Endast kliniska tester av cellerna visar i slutändan om sådana celler är tillräckligt säkra för rutinanvändning hos patienter, men våra studier av klonade djur har visat att kloner är friska. I utgåvan av Science den 30 november 2001 rapporterade vi om vår framgång hittills med kloning av nötkreatur. Av 30 klonade nötkreatur dog sex kort efter födseln, men resten har haft normala resultat vid fysiska undersökningar, och tester av deras immunsystem visar att de inte skiljer sig från vanliga nötkreatur. Två av korna har till och med fött friska kalvar.

Kloningsprocessen verkar också återställa ”åldringsklockan” i klonade celler, så att cellerna verkar yngre på vissa sätt än cellerna från vilka de klonades. År 2000 rapporterade vi att telomer på locken i ändarna av kromosomer från klonade kalvar är lika långa som de från kontrollkalvarna. Telomerer förkortas normalt eller skadas när en organism åldras. Terapeutisk kloning kan ge ”unga” celler för en åldrande befolkning.

En rapport i juli förra året av Rudolf Jaenisch från Whitehead Institute for Biomedical Research i Cambridge, Mass., Och hans kollegor fick stor uppmärksamhet eftersom den fann det -kallade präglingsfel hos klonade möss. Imprinting är en typ av stämpel som placeras på många gener i däggdjur som förändrar hur generna slås på eller av beroende på om generna ärvs från mamman eller fadern. Imprinting-programmet ”återställs” i allmänhet under embryonal utveckling.

Även om imprinting verkar spela en viktig roll hos möss, vet ingen ännu hur viktigt fenomenet är för människor.Dessutom studerade Jaenisch och hans medarbetare inte möss klonade från celler som tagits från kropparna hos vuxna, såsom fibroblaster eller cumulusceller. Istället undersökte de möss klonade från embryonala celler, vilket kan förväntas vara mer varierande. Studier som visar att imprinting är normalt hos möss klonade från vuxna celler är för närvarande i press och bör publiceras i den vetenskapliga litteraturen inom flera månader.

Samtidigt fortsätter vi våra terapeutiska kloningsexperiment för att generera klonade eller partenogenetiskt producerade humana embryon som ger stamceller. Forskare har bara börjat använda den här viktiga resursen.

FÖRFATTARNA:

JOSE B. CIBELLI, ROBERT P. LANZA och MICHAEL D. WEST är vice president för forskning, vice president för medicinsk och vetenskaplig utveckling, och vd respektive vd för Advanced Cell Technology, ett privatägt bioteknikföretag i Worcester, Mass Cibelli fick sin DVM från universitetet i La Plata i Argentina och sin doktorsexamen från University of Massachusetts i Amherst. Hans forskning ledde till skapandet av de första klonade genetiskt modifierade kalvarna 1998. Lanza har en doktorsexamen från University of Pennsylvania. Han är tidigare Fulbright-forskare och är författare eller redaktör för många populära och vetenskapliga böcker, inklusive texten Principles of Tissue Engineering. West har en doktorsexamen frånBaylor College of Medicine och är särskilt intresserad av åldrande och stamceller. Från 1990 till 1998 var han grundare, regissör och vice president för Geron Corporation i Menlo Park, Kalifornien, där han initierade och hanterade forskningsprogram inom telomerernas biologi (ändarna på kromosomer, som krymper under åldrandet) och försöket att härleda humana embryonala stamceller. Carol Ezzell är personalförfattare och redaktör.

MER ATT UTFORSKA:

Utsikterna för användning av kärnöverföring vid mänsklig transplantation. Robert P. Lanza, Jose B. Cibelli och Michael D West in NatureBiotechnology, Vol. 17, nr 12, sidor 11711174; December 1999.

Den etiska giltigheten att använda kärnöverföring vid humantransplantation. Robert P. Lanza et al. i Journal of the American Medical Association, Vol. 284, nr 24; 27 december 2000.

Forskningsdebatter om mänskligt embryo: bioetik i kontroversens virvel. Ronald M. Green. Oxford University Press, 2001.

Den fullständiga texten i vår artikel i e-biomed: The Journal of Regenerative Medicine kan ses på www.liebertpub.com/ebi