Următorul pas a fost recrutarea femeilor dispuse să contribuie cu ouă pentru a fi utilizate în procedura de clonare și, de asemenea, colectarea celulelor de la indivizii care vor fi clonați (donatorii). Procesul de clonare pare simplu, dar succesul depinde de mulți factori mici, dintre care nu înțeleg încă. În tehnica de bază a transferului nuclear, oamenii de știință folosesc un ac extrem de fin pentru a aspira materialul genetic dintr-un ou matur. Ei apoi injectează nucleul celulei donatoare (sau uneori o celulă întreagă) în oul enucleat și incubează în condiții speciale care îl determină să se împartă și să crească.

Am găsit femei dispuse să contribuie cu ouă în mod anonim pentru a fi utilizate în cercetarea noastră, plasând reclame în publicații din zona Bostonului . Am acceptat doar femei cu vârste cuprinse între 24 și 32 de ani care aveau cel puțin un copil. Interesant este faptul că propunerea noastră a făcut apel la un subgrup diferit de femei decât cele care altfel ar putea contribui cu ouă la cuplurile infertile pentru utilizare în fertilizarea in vitro. Femeile care au răspuns la anunțurile noastre au fost motivate să-și dea ouăle pentru cercetare, dar multe nu ar fi fost interesate ca ouăle să fie folosite pentru a genera un copil pe care nu l-ar vedea niciodată. (Donatorii au fost recrutați și ouăle au fost colectate de o echipă condusă de Ann A. Kiessling-Cooper de la Duncan Holly Biomedical din Somerville, Massachusetts. Kiessling a făcut, de asemenea, parte din deliberările privind problemele etice legate de contribuitorii de ouă.)

Le-am cerut potențialilor contribuabili la ouă să se supună testelor psihologice și fizice, inclusiv screening-ului pentru bolile infecțioase, pentru a ne asigura că femeile sunt sănătoase și că ouăle care contribuie nu le vor afecta negativ. Am ajuns cu 12 femei care au fost candidați buni la contribuția ouălor. Între timp, am luat biopsii cutanate de la mai mulți alți indivizi anonimi pentru a izola celulele numite fibroblaste pentru a fi utilizate în procedura de clonare. Grupul nostru de donatori de fibroblaste include persoane de vârste diferite care sunt în general sănătoase sau care au o tulburare precum diabetul sau leziunea măduvei spinării tipurile de persoane care ar putea beneficia de clonarea terapeutică.

Prima noastră încercare de clonare a avut loc în iulie . Momentul fiecărei încercări a depins de ciclurile menstruale ale femeilor care au contribuit cu ouă; donatorii au trebuit să facă injecții hormonale timp de câteva zile, astfel încât să ovuleze aproximativ 10 ouă simultan în loc de una sau două normale.

Am avut o licărire de succes în cel de-al treilea ciclu de încercări când nucleul unui fibroblast injectat părea să se divizeze, dar nu s-a despicat niciodată pentru a forma două celule distincte. Deci, în următorul ciclu am decis să luăm tacheta folosită de Teruhiko Wakayama și colegii săi, oamenii de știință care au creat primii șoareci clonați în 1998. (Wakayama era atunci la Universitatea din Hawaii și acum se află la Advanced Cell Technology.) Deși am injectat unele dintre ouă cu nuclee din fibroblaste cutanate ca de obicei, am injectat altele cu celule ovariene numite celule cumulus care, de obicei, hrănesc ouă în dezvoltare în ovar și care pot fi găsite încă agățate de ovule după ovulație. Celulele cumulului sunt atât de mici încât pot fi injectate întregi. În cele din urmă, a fost nevoie de un total de 71 de ouă de la șapte voluntari înainte ca noi să putem genera primul embrion timpuriu clonat. Dintre cele opt ouă pe care le-am injectat cu celule cumulus, două s-au împărțit pentru a forma embrioni timpurii de patru celule și una a progresat la cel puțin șase celule înainte ca creșterea să se oprească. am putea induce ouăle umane să se împartă în embrioni timpurii fără a fi fertilizați de un spermă sau a fi enuclerați și injectați cu o celulă donatoare. Deși ouăle și spermatozoizii maturi au în mod normal doar jumătate din materialul genetic al unei celule tipice ale corpului, pentru a împiedica un embrion să aibă un set dublu de gene după concepție, ouăle își înjumătățesc complementul genetic relativ târziu în ciclul lor de maturare. Dacă sunt activate înainte de etapa respectivă, ele păstrează totuși un set complet de gene.

Celule stem derivate din astfel de celule activate partenogenetic ar fi puțin probabil să fie respinse după transplant, deoarece acestea ar fi foarte asemănătoare cu celulele proprii ale pacienților și nu ar produce multe molecule care nu ar fi familiarizate cu sistemul imunitar al persoanelor. (Ele nu ar fi identice cu celulele individuale din cauza amestecării genelor care apare întotdeauna în timpul formării ovulelor și spermei.) Astfel de celule ar putea ridica mai puține dileme morale pentru unii oameni decât ar fi celulele stem derivate din embrioni timpurii clonați.

Într-un scenariu, o femeie cu boli de inimă ar putea avea propriile ovule colectate și activate în laborator pentru a produce blastocisti. Oamenii de știință ar putea folosi apoi combinații de factori de creștere pentru a convinge celulele stem izolate din blastocisti pentru a deveni celule musculare cardiace care cresc în vase de laborator care ar putea fi implantate înapoi în femeie pentru a patch-o zonă bolnavă a inimii. Utilizarea unei tehnici similare, numită androgeneza, pentru a crea celule stem pentru tratarea unui om ar fi mai dificilă. Dar s-ar putea să implice transferul a două nuclee din sperma omului într-un ovul contribuit care fusese dezbrăcat din nucleul său.

Cercetătorii au raportat anterior că i-au cerut ouălor de la șoareci și iepuri să se divizeze în embrioni expunându-i la diferite substanțe chimice. sau stimuli fizici, cum ar fi un șoc electric. Încă din 1983, Elizabeth J. Robertson, care se află acum la Universitatea Harvard, a demonstrat că celulele stem izolate din embrioni partenogenetici de șoarece ar putea forma o varietate de țesuturi, inclusiv nervoase și musculare.

În experimentele noastre de partenogeneză, am expus 22 de ouă la substanțe chimice care au modificat concentrația atomilor încărcați numiți ioni din interiorul celulelor. După cinci zile de creștere în feluri de mâncare de cultură, șase ouă se transformaseră în ceea ce părea a fi blastocisti, dar conținea în mod neclar așa-numita masă celulară internă care produce celule stem.

De ce am făcut-o

SUNTEM FERICIȚI PENTRU ZI, când vom putea oferi pacienților bolnavi clonarea terapeutică sau terapia celulară care rezultă din partenogeneză. În prezent, eforturile noastre se concentrează pe boli ale sistemului nervos și cardiovascular și pe diabet, tulburări autoimune și boli care implică sângele și măduva osoasă.

Odată ce suntem capabili să obținem celule nervoase din embrioni clonați, sperăm nu numai să vindecăm măduva spinării deteriorate, ci să tratăm tulburări ale creierului, cum ar fi boala Parkinsons, în care moartea celulelor creierului care produc o substanță numită dopamina duce la tremurături incontrolabile și paralizie. Boala Alzheimer, accident vascular cerebral și epilepsimia pot, de asemenea, să cedeze unei astfel de abordări.

Pe lângă celulele insulelor pancreatice producătoare de insulină pentru tratarea diabetului, celulele stem de la embrioni clonați ar putea fi, de asemenea, împinse pentru a deveni celule musculare ale inimii ca terapii pentru inima congestivă. insuficiență, aritmii și țesut cardiac marcat de atacuri de cord.

O aplicație potențial și mai interesantă ar putea implica determinarea celulelor stem clonate să se diferențieze în celule ale sângelui și măduvei osoase. Tulburările autoimune, cum ar fi scleroza multiplă și artrita reumatoidă, apar atunci când celulele albe din sânge ale sistemului imunitar, care apar din măduva osoasă, atacă propriile țesuturi ale corpului. Studiile preliminare au arătat că pacienții cu cancer care aveau și boli autoimune au beneficiat de ameliorarea simptomelor autoimune după ce au primit transplanturi de măduvă osoasă pentru a înlocui propria măduvă care fusese ucisă prin chimioterapie cu doze mari pentru tratarea cancerului. Infuziile de celule stem clonate formatoare de sânge sau hematopoietice ar putea „reporni” sistemul imunitar al persoanelor cu boli autoimune.

Dar celulele clonate sau cele generate prin partenogeneză sunt normale? Numai testele clinice ale celulelor vor arăta în cele din urmă dacă aceste celule sunt suficient de sigure pentru utilizarea de rutină la pacienți, dar studiile noastre pe animale clonate au arătat că clonele sunt sănătoase. În ediția din 30 noiembrie 2001 a Științei, am raportat succesul nostru până în prezent cu clonarea vitelor. Din 30 de bovine clonate, șase au murit la scurt timp după naștere, dar restul au avut rezultate normale la examenele fizice, iar testele sistemului imunitar arată că nu diferă de bovinele obișnuite. Două dintre vaci au născut chiar viței sănătoși.

Procesul de clonare pare, de asemenea, să reseteze „ceasul de îmbătrânire” din celulele clonate, astfel încât celulele să pară mai tinere în anumite privințe decât celulele din care provin. au fost clonate. În 2000, am raportat că telomerele capace la capetele cromozomilor de la vițeii clonați sunt la fel de lungi ca și cele de la vițe martor. Telomerii se scurtează în mod normal sau sunt deteriorați pe măsură ce un organism îmbătrânește. Clonarea terapeutică poate oferi celule „tinere” pentru o populație îmbătrânită.

Un raport în iulie trecut de Rudolf Jaenisch de la Whitehead Institute for Biomedical Research din Cambridge, Massachusetts, și colegii săi, au câștigat multă atenție, deoarece au descoperit că -numite defecte de imprimare la șoareci clonați. Imprimarea este un tip de ștampilă plasat pe multe gene la mamifere care schimbă modul în care genele sunt activate sau dezactivate în funcție de faptul dacă genele sunt moștenite de la mamă sau tată. Programul de imprimare este în general „resetat” în timpul dezvoltării embrionare.

Deși imprimarea pare să joace un rol important la șoareci, nimeni nu știe încă cât de semnificativ este fenomenul pentru oameni.În plus, Jaenisch și colegii săi de muncă nu au studiat șoareci clonați din celule prelevate din corpurile adulților, cum ar fi fibroblaste sau celule cumulus. În schimb, au examinat șoareci clonați din celule embrionare, care ar putea fi de așteptat să fie mai variabile. Studiile care arată că imprimarea este normală la șoarecii clonați din celule adulte sunt în prezent în presă și ar trebui publicate în literatura științifică în câteva luni.

Între timp, continuăm experimentele noastre terapeutice de clonare pentru a genera embrioni umani clonați sau produși partenogenetic, care vor produce celule stem. Oamenii de știință au început doar să exploateze această resursă importantă.

AUTORII:

JOSE B. CIBELLI, ROBERT P. LANZA și MICHAEL D. WEST sunt vicepreședinte de cercetare, vicepreședinte al Cibelli și-a primit DVM-ul pentru dezvoltarea medicală și științifică și, respectiv, președinte și CEO, Advanced Cell Technology, o companie privată de biotehnologie din Worcester, Massachusetts. de la Universitatea La Plata din Argentina și doctoratul său de la Universitatea Massachusetts din Amherst. Cercetările sale au condus la crearea primilor viței modificați genetic clonați în 1998. Lanza are un doctorat de la Universitatea din Pennsylvania. Este un fost savant Fulbright și este autorul sau editorul a numeroase cărți populare și științifice, inclusiv textul Principiile ingineriei țesuturilor. West deține un doctorat. de la Colegiul de Medicină Baylor și este deosebit de interesat de îmbătrânirea și celulele stem. Din 1990 până în 1998 a fost fondator, director și vicepreședinte al Geron Corporation din Menlo Park, California, unde a inițiat și a gestionat programe de cercetare în biologia telomerilor (capetele cromozomilor, care se micșorează în timpul îmbătrânirii) și efortul de derivare celule stem embrionare umane. Carol Ezzell este scriitor și editor.

MAI MULTE DE EXPLORAT:

Perspective pentru utilizarea transferului nuclear în transplantul uman.Robert P. Lanza, Jose B. Cibelli și Michael D . Vest în NatureBiotechnology, Vol. 17, nr. 12, paginile 11711174; Decembrie 1999.

Validitatea etică a utilizării transferului nuclear în transplantul uman. Robert P. Lanza și colab. în Jurnalul Asociației Medicale Americane, Vol. 284, nr. 24; 27 decembrie 2000.

Dezbaterile cercetării embrionilor umani: bioetica în vortexul controversei. Ronald M. Green. Oxford University Press, 2001.

Textul integral al articolului nostru în e-biomed: Journal of Regenerative Medicine poate fi vizualizat la www.liebertpub.com/ebi