O próximo passo foi recrutar mulheres dispostas a contribuir com óvulos para serem usados no procedimento de clonagem e também coletar células de indivíduos a serem clonados (os doadores). O processo de clonagem parece simples, mas o sucesso depende de muitos pequenos fatores, alguns dos quais nós ainda não entendo. Na técnica de transferência nuclear básica, os cientistas usam uma agulha extremamente fina para sugar o material genético de um ovo maduro. Eles então injetam o núcleo da célula doadora (ou às vezes uma célula inteira) no ovo enucleado e incubam sob condições especiais que o levam a se dividir e crescer.

Encontramos mulheres dispostas a contribuir com óvulos anonimamente para uso em nossa pesquisa, colocando anúncios em publicações na área de Boston . Aceitamos apenas mulheres entre 24 e 32 anos que tivessem pelo menos um filho. Curiosamente, nossa proposta atraiu um subconjunto diferente de mulheres do que aquelas que poderiam contribuir com óvulos para casais inférteis para uso na fertilização in vitro. As mulheres que responderam aos nossos anúncios estavam motivadas a dar seus óvulos para pesquisa, mas muitas não teriam se interessado em que seus óvulos fossem usados para gerar um filho que nunca veriam. (Os doadores foram recrutados e os óvulos coletados por uma equipe liderada por Ann A. Kiessling-Cooper de Duncan Holly Biomedical em Somerville, Massachusetts. Kiessling também fez parte das deliberações sobre questões éticas relacionadas aos colaboradores de óvulos.)

Pedimos aos contribuintes potenciais de óvulos que se submetessem a testes psicológicos e físicos, incluindo triagem de doenças infecciosas, para garantir que as mulheres estavam saudáveis e que a contribuição dos óvulos não as afetaria adversamente. Acabamos com 12 mulheres que eram boas candidatas a contribuir com óvulos. Nesse ínterim, fizemos biópsias de pele de vários outros indivíduos anônimos para isolar células chamadas fibroblastos para uso no procedimento de clonagem. Nosso grupo de doadores de fibroblastos inclui pessoas de várias idades que são geralmente saudáveis ou que têm doenças como diabetes ou lesão da medula espinhal – os tipos de pessoas que podem se beneficiar com a clonagem terapêutica.

Nossa primeira tentativa de clonagem ocorreu em julho passado . O tempo de cada tentativa dependia dos ciclos menstruais das mulheres que contribuíram com óvulos; as doadoras tiveram que tomar injeções de hormônio por vários dias para que ovulassem 10 ou mais óvulos de uma vez, em vez do normal ou dois.

Tivemos um vislumbre de sucesso no terceiro ciclo de tentativas, quando o o núcleo de um fibroblasto injetado parecia se dividir, mas nunca se clivou para formar duas células distintas. Portanto, no próximo ciclo, decidimos seguir o caminho usado por Teruhiko Wakayama e seus colegas, os cientistas que criaram os primeiros ratos clonados em 1998. (Wakayama estava na Universidade do Havaí e agora está na Advanced Cell Technology.) Embora nós injetamos alguns dos óvulos com núcleos de fibroblastos da pele como de costume, injetamos outros com células ovarianas chamadas células cumulus, que geralmente nutrem óvulos em desenvolvimento no ovário e que ainda podem ser encontrados agarrados aos óvulos após a ovulação. As células cumulus são tão pequenas que podem ser injetadas inteiras. No final, levou um total de 71 óvulos de sete voluntários antes que pudéssemos gerar nosso primeiro embrião clonado. Dos oito óvulos que injetamos com células cumulus, dois se dividiram para formar embriões iniciais de quatro células e um progrediu para pelo menos seis células antes que o crescimento parasse.

Partenogênese

TAMBÉM PROCURAMOS DETERMINAR se poderíamos induzir óvulos humanos a se dividirem em embriões precoces sem serem fertilizados por um espermatozóide ou enucleados e injetados com uma célula doadora. Embora óvulos e espermatozóides maduros normalmente tenham apenas metade do material genético de uma célula corporal típica, para evitar que um embrião tenha um conjunto duplo de genes após a concepção, os óvulos reduzem pela metade seu complemento genético relativamente tarde em seu ciclo de maturação. Se ativados antes desse estágio, eles ainda retêm um conjunto completo de genes.

Células-tronco derivadas de tais células ativadas partenogeneticamente seria improvável que fossem rejeitados após o transplante porque seriam muito semelhantes às células do próprio paciente e não produziriam muitas moléculas que seriam desconhecidas para o sistema imunológico da pessoa. (Elas não seriam idênticas às células individuais por causa do embaralhamento de genes que sempre ocorre durante a formação de óvulos e espermatozoides.) Essas células também podem criar menos dilemas morais para algumas pessoas do que as células-tronco derivadas de embriões clonados.

Em um cenário, uma mulher com doença cardíaca pode ter seus próprios óvulos coletados e ativados em laboratório para produzir blastocistos. Os cientistas poderiam então usar combinações de fatores de crescimento para induzir as células-tronco isoladas dos blastocistos a se tornarem células do músculo cardíaco crescendo em pratos de laboratório que poderiam ser implantados de volta na mulher para remendar uma área doente do coração. Usar uma técnica semelhante, chamada androgênese, para criar células-tronco para tratar um homem seria mais complicado. Mas pode envolver a transferência de dois núcleos do esperma do homem para um óvulo contribuído que teve seu núcleo despojado.

Pesquisadores relataram anteriormente que os óvulos de camundongos e coelhos se dividiram em embriões ao expô-los a diferentes produtos químicos ou estímulos físicos, como um choque elétrico. Já em 1983, Elizabeth J. Robertson, que agora está na Universidade de Harvard, demonstrou que as células-tronco isoladas de embriões partenogenéticos de camundongos podem formar uma variedade de tecidos, incluindo nervos e músculos.

Em nossos experimentos de partenogênese, expusemos 22 ovos a substâncias químicas que mudaram a concentração de átomos carregados chamados íons dentro das células. Depois de cinco dias de cultivo em placas de cultura, seis ovos desenvolveram-se no que parecia ser blastocistos, mas continham de forma imperceptível a chamada massa celular interna que produz células-tronco.

Por que fizemos isso

ESTAMOS ANSIOSOS POR O DIA em que poderemos oferecer clonagem terapêutica ou terapia celular decorrente da partenogênese a pacientes enfermos. Atualmente, nossos esforços estão focados em doenças dos sistemas nervoso e cardiovascular e em diabetes, distúrbios autoimunes e doenças envolvendo o sangue e a medula óssea.

Assim que formos capazes de derivar células nervosas de embriões clonados, esperamos não apenas curar a medula espinhal danificada, mas também tratar distúrbios cerebrais, como a doença de Parkinson, na qual a morte de células cerebrais que produzem uma substância chamada a dopamina leva a tremores incontroláveis e paralisia. Doença de Alzheimer, acidente vascular cerebral e epilepsia também rendem a essa abordagem.

Além das células das ilhotas pancreáticas produtoras de insulina para o tratamento de diabetes, as células-tronco de embriões clonados também podem ser estimuladas a se tornarem células do músculo cardíaco como terapias para o coração congestivo falha, arritmias e tecido cardíaco marcado por ataques cardíacos.

Uma aplicação potencialmente ainda mais interessante poderia envolver solicitar que células-tronco clonadas se diferenciassem em células do sangue e da medula óssea. Doenças autoimunes, como esclerose múltipla e artrite reumatóide, surgem quando os glóbulos brancos do sistema imunológico, que surgem da medula óssea, atacam os próprios tecidos do corpo. Estudos preliminares mostraram que pacientes com câncer que também tinham doenças autoimunes obtiveram alívio dos sintomas autoimunes depois de receberem transplantes de medula óssea para substituir sua própria medula que havia sido morta pela quimioterapia de alta dose para tratar o câncer. Infusões de células-tronco clonadas, formadoras de sangue ou hematopoéticas, podem “reiniciar” o sistema imunológico de pessoas com doenças autoimunes.

Mas as células clonadas ou geradas por partenogênese são normais? Apenas os testes clínicos das células irão mostrar, em última instância, se tais células são seguras o suficiente para uso rotineiro em pacientes, mas nossos estudos de animais clonados mostraram que os clones são saudáveis. Na edição de 30 de novembro de 2001 da Science, relatamos nosso sucesso até o momento com a clonagem de gado. De 30 bovinos clonados, seis morreram logo após o nascimento, mas o restante teve resultados normais nos exames físicos e os testes de seu sistema imunológico mostram que eles não diferem do gado normal. Duas das vacas até deram à luz bezerros saudáveis.

O processo de clonagem também parece zerar o “relógio do envelhecimento” nas células clonadas, de modo que as células parecem mais jovens em alguns aspectos do que as células das quais foram clonados. Em 2000, relatamos que os telômeros e as tampas das extremidades dos cromossomos de bezerros clonados são tão longos quanto os de bezerros controle. Os telômeros normalmente encurtam ou são danificados com o envelhecimento do organismo. A clonagem terapêutica pode fornecer células “jovens” para uma população em envelhecimento.

Um relatório de julho passado por Rudolf Jaenisch, do Instituto Whitehead de Pesquisa Biomédica em Cambridge, Massachusetts, e seus colegas ganharam muita atenção porque descobriram que sim chamados de defeitos de impressão em camundongos clonados. Imprinting é um tipo de selo colocado em muitos genes em mamíferos que muda a forma como os genes são ativados ou desativados, dependendo se os genes são herdados da mãe ou do pai. O programa de impressão é geralmente “reiniciado” durante o desenvolvimento embrionário.

Embora a impressão pareça desempenhar um papel importante em ratos, ninguém ainda sabe o quão significativo o fenômeno é para os humanos.Além disso, Jaenisch e seus colegas não estudaram ratos clonados de células retiradas de corpos de adultos, como fibroblastos ou células cumulus. Em vez disso, eles examinaram camundongos clonados de células embrionárias, que podem ser mais variáveis. Estudos mostrando que o imprinting é normal em camundongos clonados de células adultas estão atualmente no prelo e devem ser publicados na literatura científica dentro de alguns meses.

Enquanto isso, continuamos nossos experimentos de clonagem terapêutica para gerar embriões humanos clonados ou produzidos partenogeneticamente que produzirão células-tronco. Os cientistas apenas começaram a explorar este importante recurso.

OS AUTORES:

JOSE B. CIBELLI, ROBERT P. LANZA e MICHAEL D. WEST são vice-presidente de pesquisa e vice-presidente de desenvolvimento médico e científico, e presidente e CEO, respectivamente, da Advanced Cell Technology, uma empresa privada de biotecnologia em Worcester, Massachusetts. Cibelli recebeu seu DVM da Universidade de La Plata na Argentina e seu Ph.D. da Universidade de Massachusetts em Amherst. Sua pesquisa levou à criação dos primeiros bezerros geneticamente modificados clonados em 1998. Lanza tem um M.D. pela Universidade da Pensilvânia. Ele é um ex-estudioso da Fulbright e é o autor ou editor de vários livros populares e científicos, incluindo o texto Princípios de Engenharia de Tecidos. West possui um Ph.D. do Baylor College of Medicine e está particularmente interessado em envelhecimento e células-tronco. De 1990 a 1998 ele foi fundador, diretor e vice-presidente da Geron Corporation em Menlo Park, Califórnia, onde iniciou e gerenciou programas de pesquisa na biologia de telômeros (as extremidades dos cromossomos, que encolhem durante o envelhecimento) e o esforço para derivar células-tronco embrionárias humanas. Carol Ezzell é redatora e editora da equipe.

MAIS PARA EXPLORAR:

Perspectivas para o uso de transferência nuclear no transplante humano. Robert P. Lanza, Jose B. Cibelli e Michael D West in NatureBiotechnology, Vol. 17, No. 12, páginas 11711174; Dezembro 1999.

A validade ética do uso de transferência nuclear no transplante humano. Robert P. Lanza et al. no Journal of the American Medical Association, Vol. 284, No. 24; 27 de dezembro de 2000.

Os debates da pesquisa em embriões humanos: a bioética no vórtice da controvérsia. Ronald M. Green. Oxford University Press, 2001.

O texto completo de nosso artigo em e-biomed: The Journal of Regenerative Medicine pode ser visto em www.liebertpub.com/ebi