Następnym krokiem było rekrutowanie kobiet chętnych do oddawania komórek jajowych do wykorzystania w procedurze klonowania, a także zbieranie komórek od osobników do klonowania (dawców). Proces klonowania wydaje się prosty, ale sukces zależy od wielu małych czynników, z których część jeszcze nie rozumiem. W podstawowej technice transferu jądra, naukowcy używają bardzo cienkiej igły do wysysania materiału genetycznego z dojrzałego jaja. Następnie wstrzykują jądro komórki dawcy (lub czasami całą komórkę) do usuniętego jaja i inkubują w specjalnych warunkach, które skłaniają go do dzielenia się i wzrostu.

Znaleźliśmy kobiety chętne do anonimowego przekazywania jajek do wykorzystania w naszych badaniach, umieszczając reklamy w publikacjach w okolicach Bostonu . Przyjmowaliśmy tylko kobiety w wieku od 24 do 32 lat, które miały co najmniej jedno dziecko. Co ciekawe, nasza propozycja przemówiła do innej podgrupy kobiet niż te, które w innym przypadku mogłyby dostarczać jaja niepłodnym parom do wykorzystania w zapłodnieniu in vitro. Kobiety, które odpowiedziały na nasze ogłoszenia, były zmotywowane do oddania swoich jajek do badań, ale wiele z nich nie byłoby zainteresowanych wykorzystaniem ich jaj do zrodzenia dziecka, którego nigdy nie zobaczą. (Darczyńcy zostali zrekrutowani, a komórki jajowe zebrał zespół kierowany przez Ann A. Kiessling-Cooper z Duncan Holly Biomedical w Somerville w stanie Massachusetts. Kiessling był również częścią obrad dotyczących kwestii etycznych związanych z ofiarodawcami jaj.)

Poprosiliśmy potencjalnych dostawców jaj o poddanie się testom psychologicznym i fizycznym, w tym badaniom przesiewowym na choroby zakaźne, aby upewnić się, że kobiety są zdrowe i że dostarczanie jaj nie wpłynie na nie negatywnie. Skończyło się na 12 kobietach, które były dobrymi kandydatami do składania jaj. W międzyczasie pobraliśmy biopsje skóry od kilku innych anonimowych osób, aby wyizolować komórki zwane fibroblastami do wykorzystania w procedurze klonowania. Nasza grupa dawców fibroblastów obejmuje osoby w różnym wieku, ogólnie zdrowe lub cierpiące na schorzenia, takie jak cukrzyca lub uraz rdzenia kręgowego, osoby, które mogą odnieść korzyści z klonowania terapeutycznego.

Nasza pierwsza próba klonowania miała miejsce w lipcu ubiegłego roku. . Czas każdej próby zależał od cykli menstruacyjnych kobiet, które złożyły jaja; dawcy musieli przez kilka dni przyjmować zastrzyki hormonalne, aby owulować 10 lub więcej jaj naraz zamiast jednej lub dwóch normalnych.

Mieliśmy przebłysk sukcesu w trzecim cyklu prób, kiedy Jądro wstrzykniętego fibroblastu wydawało się dzielić, ale nigdy nie rozszczepiło się, tworząc dwie odrębne komórki. Dlatego w następnym cyklu zdecydowaliśmy się na taktykę stosowaną przez Teruhiko Wakayamę i jego współpracowników, naukowców, którzy stworzyli pierwsze sklonowane myszy w 1998 r. (Wakayama był wtedy na University of Hawaii, a teraz pracuje w Advanced Cell Technology). jak zwykle wstrzyknęliśmy niektórym jajom jądra z fibroblastów skóry, innym wstrzyknięliśmy komórki jajnika zwane komórkami wzgórka jajonośnego, które zwykle odżywiają rozwijające się komórki jajowe w jajniku i które można znaleźć nadal przylegające do jaj po owulacji. Komórki Cumulusa są tak małe, że można je wstrzykiwać w całości. Ostatecznie potrzeba było 71 jaj od siedmiu ochotników, zanim udało nam się wygenerować nasz pierwszy sklonowany wczesny zarodek. Z ośmiu jaj, którym wstrzyknięliśmy komórki wzgórka jajonośnego, dwa podzielono, aby utworzyć wczesne zarodki złożone z czterech komórek, a jedno rozwinęło się do co najmniej sześciu komórek przed zatrzymaniem wzrostu.

Partenogeneza

PROSIMY O OKREŚLENIE, czy moglibyśmy skłonić ludzkie komórki jajowe do podziału na wczesne zarodki bez zapłodnienia nasieniem lub wyłuszczenia i wstrzyknięcia komórki dawcy. Chociaż dojrzałe komórki jajowe i plemniki mają zwykle tylko połowę materiału genetycznego typowej komórki ciała, aby zapobiec posiadaniu przez zarodek podwójnego zestawu genów po zapłodnieniu, jaja zmniejszają o połowę swój dopełniacz genetyczny stosunkowo późno w cyklu dojrzewania. Jeśli zostaną aktywowane przed tym etapem, nadal zachowują pełny zestaw genów.

Komórki macierzyste pochodzące z takich partenogenetycznie aktywowanych komórek jest mało prawdopodobne, aby zostały odrzucone po przeszczepie, ponieważ byłyby bardzo podobne do komórek własnych pacjenta i nie wytwarzałyby wielu cząsteczek, które byłyby nieznane układowi odpornościowemu osoby. (Nie byłyby identyczne z poszczególnymi komórkami ze względu na tasowanie genów, które zawsze występuje podczas tworzenia komórek jajowych i nasienia). Takie komórki mogą również budzić mniej dylematów moralnych dla niektórych ludzi niż komórki macierzyste pochodzące ze sklonowanych wczesnych embrionów.

W jednym scenariuszu kobieta z chorobą serca może mieć własne komórki jajowe pobrane i aktywowane w laboratorium, aby uzyskać blastocysty. Naukowcy mogliby następnie użyć kombinacji czynników wzrostu, aby zmusić komórki macierzyste wyizolowane z blastocyst, aby stały się komórkami mięśnia sercowego rosnącymi na naczyniach laboratoryjnych, które można by wszczepić kobiecie w celu załatania chorego obszaru serca. Użycie podobnej techniki, zwanej androgenezą, do stworzenia komórek macierzystych do leczenia człowieka byłoby trudniejsze. Ale może to oznaczać przeniesienie dwóch jąder z plemników mężczyzny do komórki jajowej, która została pozbawiona jądra komórkowego.

Naukowcy wcześniej donosili, że skłaniają jaja myszy i królików do podziału na zarodki poprzez wystawianie ich na działanie różnych chemikaliów. lub bodźce fizyczne, takie jak porażenie prądem. Już w 1983 roku Elizabeth J. Robertson, która jest obecnie na Uniwersytecie Harvarda, wykazała, że komórki macierzyste wyizolowane z embrionów myszy partenogenetycznych mogą tworzyć różne tkanki, w tym nerwy i mięśnie.

W naszych eksperymentach z partenogenezą: wystawiliśmy 22 jaja na działanie substancji chemicznych, które zmieniły stężenie naładowanych atomów zwanych jonami wewnątrz komórek. Po pięciu dniach wzrostu na szalkach hodowlanych sześć jaj rozwinęło się w coś, co wyglądało na blastocysty, ale zawierało niewyraźną tak zwaną wewnętrzną masę komórkową, z której pochodzą komórki macierzyste.

Dlaczego to zrobiliśmy

JESTEŚMY WCIĄŻ NA DZIEŃ, kiedy będziemy mogli zaoferować chorym pacjentom klonowanie terapeutyczne lub terapię komórkową powstałą w wyniku partenogenezy. Obecnie nasze działania koncentrują się na chorobach układu nerwowego i sercowo-naczyniowego, cukrzycy, chorobach autoimmunologicznych oraz chorobach krwi i szpiku kostnego.

Kiedy już będziemy w stanie uzyskać komórki nerwowe ze sklonowanych embrionów, mamy nadzieję nie tylko wyleczyć uszkodzone rdzenie kręgowe, ale także leczyć zaburzenia mózgu, takie jak choroba Parkinsona, w której śmierć komórek mózgowych wytwarzających substancję zwaną dopamina prowadzi do niekontrolowanych drżeń i paraliżu. Choroba Alzheimera, udar mózgu i epilepsja również mogą ulec temu podejściu.

Oprócz komórek wysp trzustkowych wytwarzających insulinę do leczenia cukrzycy, komórki macierzyste ze sklonowanych embrionów mogą również zostać zmuszone do przekształcenia się w komórki mięśnia sercowego jako terapię zastoinową serca niewydolność serca, zaburzenia rytmu serca i blizny w tkance serca w wyniku zawału serca.

Potencjalnie jeszcze ciekawsze zastosowanie mogłoby obejmować zachęcanie sklonowanych komórek macierzystych do różnicowania się w komórki krwi i szpiku kostnego. Choroby autoimmunologiczne, takie jak stwardnienie rozsiane i reumatoidalne zapalenie stawów, pojawiają się, gdy białe krwinki układu odpornościowego, które powstają ze szpiku kostnego, atakują własne tkanki organizmu. Wstępne badania wykazały, że pacjenci z rakiem, którzy również cierpieli na choroby autoimmunologiczne, odczuwali ulgę w objawach autoimmunologicznych po otrzymaniu przeszczepu szpiku kostnego w celu zastąpienia własnego szpiku, który został zabity przez chemioterapię w wysokich dawkach w celu leczenia raka. Infuzje krwiotwórczych lub hematopoetycznych sklonowanych komórek macierzystych mogą „zrestartować” układ odpornościowy osób z chorobami autoimmunologicznymi.

Ale czy sklonowane komórki, czy te wytworzone w wyniku partenogenezy, są normalne? Tylko testy kliniczne komórek pokażą ostatecznie, czy takie komórki są wystarczająco bezpieczne do rutynowego stosowania u pacjentów, ale nasze badania na sklonowanych zwierzętach wykazały, że klony są zdrowe. W Science z 30 listopada 2001 r. Pisaliśmy o naszych dotychczasowych sukcesach w klonowaniu bydła. Spośród 30 sklonowanych bydła sześć zmarło wkrótce po urodzeniu, ale reszta miała normalne wyniki w badaniach fizycznych, a testy ich układu odpornościowego wykazały, że nie różnią się one od zwykłego bydła. Dwie z krów urodziły nawet zdrowe cielęta.

Wydaje się, że proces klonowania resetuje „zegar starzenia” w sklonowanych komórkach, tak że komórki wydają się młodsze w pewnym sensie niż komórki, z których pochodzą zostały sklonowane. W 2000 roku donosiliśmy, że czapki telomerowe na końcach chromosomów klonowanych cieląt są tak samo długie, jak te z cieląt kontrolnych. Telomery zwykle skracają się lub ulegają uszkodzeniu w miarę starzenia się organizmu. Klonowanie terapeutyczne może dostarczyć „młodych” komórek dla starzejącej się populacji.

Raport Rudolfa Jaenischa z Whitehead Institute for Biomedical Research w Cambridge w stanie Massachusetts w lipcu ubiegłego roku i jego współpracowników przyciągnął wiele uwagi, ponieważ – nazywane defektami odciskania u sklonowanych myszy. Nadruk to rodzaj stempla umieszczanego na wielu genach u ssaków, który zmienia sposób włączania lub wyłączania genów w zależności od tego, czy geny są dziedziczone po matce, czy po ojcu. Program imprintingu jest generalnie „resetowany” podczas rozwoju embrionalnego.

Chociaż wydaje się, że imprinting odgrywa ważną rolę u myszy, nikt jeszcze nie wie, jak znaczące jest to zjawisko dla ludzi.Ponadto Jaenisch i jego współpracownicy nie badali myszy sklonowanych z komórek pobranych z ciał dorosłych, takich jak fibroblasty czy komórki wzgórka. Zamiast tego zbadali myszy sklonowane z komórek embrionalnych, co do których można się spodziewać, że będą bardziej zmienne. Badania pokazujące, że wdrukowanie jest normalne u myszy sklonowanych z komórek dorosłych, są obecnie w druku i powinny zostać opublikowane w literaturze naukowej w ciągu kilku miesięcy.

W międzyczasie kontynuujemy nasze eksperymenty z klonowaniem terapeutycznym, aby wygenerować sklonowane lub wytworzone partenogenetycznie ludzkie embriony, z których uzyskają komórki macierzyste. Naukowcy dopiero zaczęli korzystać z tego ważnego źródła.

AUTORZY:

JOSE B. CIBELLI, ROBERT P. LANZA i MICHAEL D. WEST są wiceprezesem ds. Badań, wiceprezesem rozwój medyczny i naukowy oraz odpowiednio prezes i dyrektor generalny Advanced Cell Technology, prywatnej firmy biotechnologicznej w Worcester w stanie Massachusetts. Cibelli otrzymał dyplom DVM z Uniwersytetu La Plata w Argentynie i jego doktoratu. z Uniwersytetu Massachusetts w Amherst. Jego badania doprowadziły do stworzenia pierwszych sklonowanych genetycznie zmodyfikowanych cieląt w 1998 r. Lanza ma tytuł doktora nauk medycznych z University of Pennsylvania. Jest byłym stypendystą Fulbrighta i autorem lub redaktorem wielu książek popularno-naukowych, w tym tekstu Principles of Tissue Engineering. West posiada doktorat. z Baylor College of Medicine i szczególnie interesuje się starzeniem się i komórkami macierzystymi. W latach 1990-1998 był założycielem, dyrektorem i wiceprezesem Geron Corporation w Menlo Park w Kalifornii, gdzie inicjował i kierował programami badawczymi z zakresu biologii telomerów (końcówek chromosomów, które kurczą się podczas starzenia) oraz wysiłków zmierzających do uzyskania ludzkie embrionalne komórki macierzyste. Carol Ezzell jest redaktorką i redaktorką.

WIĘCEJ DO ODKRYCIA:

Perspektywy wykorzystania transferu jądrowego w transplantacji ludzi. Robert P. Lanza, Jose B. Cibelli i Michael D. , Zachód w NatureBiotechnology, tom. 17, nr 12, strony 11711174; Grudzień 1999.

Etyczna ważność wykorzystania transferu jądrowego w transplantacji ludzi. Robert P. Lanza i in. w Journal of the American Medical Association, Vol. 284, nr 24; 27 grudnia 2000.

Debaty dotyczące badań nad embrionem ludzkim: bioetyka w wirze kontrowersji. Ronald M. Green. Oxford University Press, 2001.

Pełny tekst naszego artykułu w e-biomed: The Journal of Regenerative Medicine można obejrzeć pod adresem www.liebertpub.com/ebi