De volgende stap was het rekruteren van vrouwen die bereid waren eieren bij te dragen voor gebruik in de kloonprocedure en ook om cellen te verzamelen van te klonen individuen (de donoren). Het kloonproces lijkt eenvoudig, maar het succes hangt af van veel kleine factoren, waarvan we sommige begrijp het nog niet. In de basale nucleaire overdrachtstechniek gebruiken wetenschappers een extreem fijne naald om het genetisch materiaal uit een volwassen ei te zuigen. Vervolgens injecteren ze de kern van de donorcel (of soms een hele cel) in het verwijderde ei en incuberen het onder speciale omstandigheden die het ertoe aanzetten om te delen en te groeien.

We vonden vrouwen die op anonieme basis eieren wilden bijdragen voor gebruik in ons onderzoek door advertenties te plaatsen in publicaties in de omgeving van BostonWe accepteerden alleen vrouwen tussen de 24 en 32 jaar die minstens één kind hadden. Interessant is dat ons voorstel een andere subgroep van vrouwen aansprak dan degenen die anders eicellen zouden bijdragen aan onvruchtbare stellen voor gebruik bij in-vitrofertilisatie. De vrouwen die op onze advertenties reageerden, waren gemotiveerd om hun eieren te geven voor onderzoek, maar velen zouden niet geïnteresseerd zijn geweest in het gebruik van hun eieren om een kind te krijgen dat ze nooit zouden zien. (De donoren werden gerekruteerd en de eieren werden verzameld door een team onder leiding van Ann A. Kiessling-Cooper van Duncan Holly Biomedical in Somerville, Massachusetts. Kiessling maakte ook deel uit van de beraadslagingen over ethische kwesties met betrekking tot de eiceldragers.)

We vroegen potentiële bijdragers van eieren om zich te onderwerpen aan psychologische en fysieke tests, inclusief screening op infectieziekten, om er zeker van te zijn dat de vrouwen gezond waren en dat bijdragende eieren geen nadelige gevolgen voor hen zouden hebben. We eindigden met 12 vrouwen die goede kandidaten waren om eieren bij te dragen. In de tussentijd hebben we huidbiopsieën genomen van verschillende andere anonieme personen om cellen, fibroblasten genaamd, te isoleren voor gebruik bij de kloonprocedure. Tot onze groep fibroblastdonoren behoren mensen van verschillende leeftijden die over het algemeen gezond zijn of die een aandoening hebben zoals diabetes of dwarslaesie, het soort mensen dat waarschijnlijk baat heeft bij therapeutisch klonen.

Onze eerste kloonpoging vond plaats afgelopen juli. . De timing van elke poging was afhankelijk van de menstruatiecycli van de vrouwen die eicellen hadden bijgedragen; de donoren moesten een aantal dagen hormooninjecties nemen, zodat ze een tiental eieren tegelijk zouden ovuleren in plaats van de normale een of twee.

We kregen een glimp van succes in de derde cyclus van pogingen toen de de kern van een geïnjecteerde fibroblast leek te delen, maar het splitste zich nooit om twee verschillende cellen te vormen. Dus in de volgende cyclus besloten we om de overstap te maken die werd gebruikt door Teruhiko Wakayama en zijn collegas, de wetenschappers die in 1998 de eerste gekloonde muizen maakten. (Wakayama zat toen aan de Universiteit van Hawaï en is nu bij Advanced Cell Technology.) Hoewel we zoals gewoonlijk injecteerden we sommige van de eicellen met kernen van huidfibroblasten, we injecteerden andere met eierstokcellen, cumuluscellen genaamd, die gewoonlijk de zich ontwikkelende eicellen in de eierstok voeden en die na de eisprong nog steeds aan de eitjes vastzitten. Cumulus-cellen zijn zo klein dat ze in hun geheel kunnen worden geïnjecteerd. Uiteindelijk waren er in totaal 71 eieren van zeven vrijwilligers nodig voordat we ons eerste gekloonde vroege embryo konden genereren. Van de acht eieren die we met cumuluscellen hebben geïnjecteerd, zijn er twee verdeeld om vroege embryos van vier cellen te vormen, en één ontwikkelde zich tot ten minste zes cellen voordat de groei stopte.

Parthenogenese

WE ZOEKEN OOK OM TE BEPALEN of we zouden menselijke eicellen kunnen laten delen in vroege embryos zonder te worden bevrucht door een sperma of te worden verwijderd en geïnjecteerd met een donorcel. Hoewel volwassen eicellen en sperma normaal gesproken slechts de helft van het genetisch materiaal van een typische lichaamscel hebben, halveren eieren relatief laat in hun rijpingscyclus om te voorkomen dat een embryo een dubbele set genen heeft na de conceptie. Als ze voor die fase worden geactiveerd, behouden ze nog steeds een volledige set genen.

Stamcellen afgeleid van dergelijke parthenogenetisch geactiveerde cellen het is onwaarschijnlijk dat ze na transplantatie worden afgewezen, omdat ze erg lijken op de eigen cellen van een patiënt en niet veel moleculen produceren die onbekend zijn voor het immuunsysteem van de persoon. (Ze zouden niet identiek zijn aan de individuele cellen vanwege de gen-shuffling die altijd plaatsvindt tijdens de vorming van eicellen en sperma.) Dergelijke cellen zouden voor sommige mensen ook minder morele dilemmas kunnen opleveren dan stamcellen die zijn afgeleid van gekloonde vroege embryos.

In één scenario kan een vrouw met een hartaandoening haar eigen eicellen laten verzamelen en in het laboratorium laten activeren om blastocysten te produceren. Wetenschappers zouden dan combinaties van groeifactoren kunnen gebruiken om stamcellen die uit de blastocysten zijn geïsoleerd, over te halen om hartspiercellen te worden die groeien in laboratoriumschaaltjes die weer in de vrouw kunnen worden geïmplanteerd om een ziek deel van het hart te herstellen. Het zou lastiger zijn om een vergelijkbare techniek, androgenese genaamd, te gebruiken om stamcellen te maken om een man te behandelen. Maar het kan inhouden dat twee kernen van het sperma van de man worden overgebracht naar een bijgedragen ei dat van zijn kern was ontdaan.

Onderzoekers hebben eerder gemeld dat ze eieren van muizen en konijnen ertoe aanzetten zich in embryos te verdelen door ze bloot te stellen aan verschillende chemicaliën of fysieke prikkels zoals een elektrische schok. Al in 1983 toonde Elizabeth J. Robertson, die nu aan de Harvard University werkt, aan dat stamcellen die uit parthenogenetische muizenembryos zijn geïsoleerd, een verscheidenheid aan weefsels kunnen vormen, waaronder zenuwen en spieren.

In onze parthenogenese-experimenten we stelden 22 eieren bloot aan chemicaliën die de concentratie van geladen atomen, ionen genaamd, in de cellen veranderden. Na vijf dagen groeien in kweekschalen, hadden zes eieren zich ontwikkeld tot wat leek op blastocysten, maar ze bevatten niet duidelijk de zogenaamde binnencelmassa die stamcellen oplevert.

Waarom we het deden

WE ZIJN ECHTER NAAR DE DAG dat we therapeutische klonen of celtherapie als gevolg van parthenogenese aan zieke patiënten kunnen aanbieden. Momenteel zijn onze inspanningen gericht op ziekten van het zenuwstelsel en het cardiovasculaire systeem en op diabetes, auto-immuunziekten en ziekten waarbij het bloed en het beenmerg betrokken zijn.

Als we eenmaal in staat zijn zenuwcellen af te leiden uit gekloonde embryos, hopen we niet alleen beschadigde ruggenmerg te genezen, maar ook hersenaandoeningen te behandelen zoals de ziekte van Parkinson, waarbij de dood van hersencellen die een stof maken genaamd dopamine leidt tot oncontroleerbare tremoren en verlamming. De ziekte van Alzheimer, beroerte en epilepsie kunnen ook wijken voor een dergelijke benadering.

Naast insulineproducerende pancreaseilandjescellen voor de behandeling van diabetes, kunnen stamcellen van gekloonde embryos ook worden aangespoord om hartspiercellen te worden als therapieën voor congestief hart hartfalen, hartritmestoornissen en hartweefsel beschadigd door hartaanvallen.

Een potentieel nog interessantere toepassing zou kunnen zijn om gekloonde stamcellen ertoe aan te zetten zich te differentiëren in cellen van bloed en beenmerg. Auto-immuunziekten zoals multiple sclerose en reumatoïde artritis ontstaan wanneer witte bloedcellen van het immuunsysteem, die voortkomen uit het beenmerg, de eigen weefsels van het lichaam aanvallen. Voorlopige studies hebben aangetoond dat kankerpatiënten die ook auto-immuunziekten hadden, verlichting kregen van auto-immuunsymptomen nadat ze beenmergtransplantaties hadden ondergaan ter vervanging van hun eigen merg dat was gedood door hoge doses chemotherapie om de kanker te behandelen. Infusies van bloedvormende of hematopoëtische, gekloonde stamcellen kunnen het immuunsysteem van mensen met auto-immuunziekten “herstarten”. Maar zijn gekloonde of door parthenogenese gegenereerde cellen normaal? Alleen klinische tests van de cellen zullen uiteindelijk uitwijzen of dergelijke cellen veilig genoeg zijn voor routinematig gebruik bij patiënten, maar onze studies van gekloonde dieren hebben aangetoond dat klonen gezond zijn. In de uitgave van 30 november 2001 van Science berichtten we over ons succes tot nu toe met het klonen van vee. Van de 30 gekloonde runderen stierven er zes kort na de geboorte, maar de rest heeft normale resultaten behaald bij lichamelijk onderzoek, en tests van hun immuunsysteem laten zien dat ze niet verschillen van gewoon vee. Twee van de koeien hebben zelfs gezonde kalveren gebaard.

Het kloonproces lijkt ook de verouderingsklok in gekloonde cellen te resetten, zodat de cellen op een bepaalde manier jonger lijken dan de cellen waaruit ze werden gekloond. In 2000 meldden we dat telomeren de kappen aan de uiteinden van chromosomen van gekloonde kalveren net zo lang zijn als die van controlekalveren. Telomeren worden normaal gesproken korter of worden beschadigd naarmate een organisme ouder wordt. Therapeutisch klonen kan jonge cellen opleveren voor een verouderende bevolking.

Een rapport afgelopen juli door Rudolf Jaenisch van het Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge, Massachusetts, en zijn collegas kreeg veel aandacht omdat het zo bleek. – de zogenaamde imprinting defecten bij gekloonde muizen. Imprinting is een soort stempel dat op veel genen bij zoogdieren wordt geplaatst en die verandert hoe de genen worden in- of uitgeschakeld, afhankelijk van of de genen worden geërfd van de moeder of de vader. Het imprinting-programma wordt over het algemeen “gereset” tijdens de embryonale ontwikkeling.

Hoewel imprinting een belangrijke rol lijkt te spelen bij muizen, weet nog niemand hoe belangrijk het fenomeen is voor mensen.Bovendien bestudeerden Jaenisch en zijn collegas geen muizen die waren gekloond uit cellen die uit het lichaam van volwassenen waren gehaald, zoals fibroblasten of cumuluscellen. In plaats daarvan onderzochten ze muizen die waren gekloond uit embryonale cellen, die naar verwachting meer variabel zouden zijn. Studies die aantonen dat imprinting normaal is bij muizen die uit volwassen cellen zijn gekloond, zijn momenteel in de pers en zouden binnen enkele maanden in de wetenschappelijke literatuur moeten worden gepubliceerd.

Ondertussen zetten we onze therapeutische kloneringsexperimenten voort om gekloonde of parthenogenetisch geproduceerde menselijke embryos te genereren die stamcellen opleveren. Wetenschappers zijn nog maar net begonnen deze belangrijke bron aan te boren.

DE AUTEURS:

JOSE B. CIBELLI, ROBERT P. LANZA en MICHAEL D. WEST zijn vice-president onderzoek, vice-president van medische en wetenschappelijke ontwikkeling, en respectievelijk president en CEO van Advanced Cell Technology, een particulier biotechnologiebedrijf in Worcester, Massachusetts. Cibelli ontving zijn DVM van de Universiteit van La Plata in Argentinië en zijn Ph.D. van de Universiteit van Massachusetts in Amherst. Zijn onderzoek leidde tot de creatie van de eerste gekloonde genetisch gemodificeerde kalveren in 1998. Lanza heeft een M.D. van de University of Pennsylvania. Hij is een voormalig Fulbright-geleerde en is de auteur of redacteur van talloze populaire en wetenschappelijke boeken, waaronder de tekst Principles of Tissue Engineering. West heeft een Ph.D. van Baylor College of Medicine en is vooral geïnteresseerd in veroudering en stamcellen. Van 1990 tot 1998 was hij oprichter, directeur en vice-president van Geron Corporation in Menlo Park, Californië, waar hij onderzoeksprogrammas initieerde en beheerde in de biologie van telomeren (de uiteinden van chromosomen, die krimpen tijdens veroudering) en de inspanning om menselijke embryonale stamcellen. Carol Ezzell is een schrijver en redacteur van het personeel.

MEER TE VERKENNEN:

Vooruitzichten voor het gebruik van nucleaire overdracht bij menselijke transplantatie.Robert P. Lanza, Jose B. Cibelli en Michael D West in NatureBiotechnology, Vol. 17, nr. 12, paginas 11711174; December 1999.

De ethische validiteit van het gebruik van nucleaire overdracht bij menselijke transplantatie. Robert P. Lanza e.a. in Journal of the American Medical Association, Vol. 284, nr. 24; 27 december 2000.

The Human Embryo Research Debates: Bioethics in the Vortex of Controversy. Ronald M. Green. Oxford University Press, 2001.

De volledige tekst van ons artikel in e-biomed: The Journal of Regenerative Medicine kan worden bekeken op www.liebertpub.com/ebi