Il passo successivo è stato quello di reclutare donne disposte a contribuire con ovociti da utilizzare nella procedura di clonazione e raccogliere anche cellule da individui da clonare (i donatori). Il processo di clonazione sembra semplice, ma il successo dipende da molti piccoli fattori, alcuni dei quali noi non capisco ancora. Nella tecnica di trasferimento nucleare di base, gli scienziati usano un ago estremamente sottile per succhiare il materiale genetico da un uovo maturo. Quindi iniettano il nucleo della cellula donatrice (o talvolta unintera cellula) nelluovo enucleato e incubano in condizioni speciali che lo spingono a dividersi e crescere.

Abbiamo trovato donne disposte a contribuire con ovociti su base anonima da utilizzare nella nostra ricerca inserendo annunci nelle pubblicazioni nellarea di Boston . Abbiamo accettato solo donne di età compresa tra 24 e 32 anni che avevano almeno un figlio. È interessante notare che la nostra proposta ha fatto appello a un diverso sottogruppo di donne rispetto a quelle che altrimenti potrebbero contribuire con ovociti a coppie infertili per la fecondazione in vitro. Le donne che hanno risposto ai nostri annunci erano motivate a dare i loro ovuli per la ricerca, ma molte non sarebbero state interessate ad usare le loro uova per generare un bambino che non avrebbero mai visto. (I donatori sono stati reclutati e gli ovuli sono stati raccolti da un team guidato da Ann A. Kiessling-Cooper di Duncan Holly Biomedical a Somerville, Massachusetts. Anche Kiessling faceva parte delle deliberazioni riguardanti le questioni etiche relative ai contributori di uova.)

Abbiamo chiesto ai potenziali contributori di ovociti di sottoporsi a test psicologici e fisici, incluso lo screening per malattie infettive, per garantire che le donne fossero sane e che il contributo degli ovociti non avrebbe avuto effetti negativi su di loro. Abbiamo finito con 12 donne che erano buone candidate per contribuire con le uova. Nel frattempo, abbiamo eseguito biopsie cutanee da diversi altri individui anonimi per isolare cellule chiamate fibroblasti da utilizzare nella procedura di clonazione. Il nostro gruppo di donatori di fibroblasti comprende persone di età variabile che sono generalmente in buona salute o che hanno un disturbo come il diabete o lesioni del midollo spinale, il tipo di persone che potrebbero trarre beneficio dalla clonazione terapeutica.

Il nostro primo tentativo di clonazione è avvenuto lo scorso luglio . La tempistica di ogni tentativo dipendeva dai cicli mestruali delle donne che fornivano le uova; i donatori dovevano fare iniezioni di ormoni per diversi giorni in modo che ovulassero circa 10 ovuli contemporaneamente invece di uno o due normali.

Abbiamo avuto un barlume di successo nel terzo ciclo di tentativi quando il nucleo di un fibroblasto iniettato sembrava dividersi, ma non si è mai tagliato per formare due cellule distinte. Quindi nel ciclo successivo abbiamo deciso di prendere la virata usata da Teruhiko Wakayama e dai suoi colleghi, gli scienziati che hanno creato i primi topi clonati nel 1998 (Wakayama era allUniversità delle Hawaii e ora è alla Advanced Cell Technology). abbiamo iniettato alcune delle uova con i nuclei dei fibroblasti della pelle come al solito, in altre abbiamo iniettato le cellule ovariche chiamate cellule cumulo che di solito nutrono le uova in via di sviluppo nellovaio e che possono essere trovate ancora attaccate alle uova dopo lovulazione. I cumuli sono così piccoli che possono essere iniettati interi. Alla fine, ci sono voluti un totale di 71 uova da sette volontari prima di poter generare il nostro primo embrione precoce clonato. Delle otto uova che abbiamo iniettato con cellule cumuli, due divise per formare embrioni precoci di quattro cellule e una progrediva fino ad almeno sei cellule prima che la crescita si fermasse.

Partenogenesi

ABBIAMO ANCHE CERCATO DI DETERMINARE se potremmo indurre gli ovuli umani a dividersi in embrioni precoci senza essere fecondati da uno sperma o essere enucleati e iniettati con una cellula donatrice. Sebbene gli ovuli maturi e lo sperma normalmente abbiano solo la metà del materiale genetico di una tipica cellula del corpo, per evitare che un embrione abbia un doppio set di geni dopo il concepimento, le uova dimezzano il loro complemento genetico relativamente tardi nel loro ciclo di maturazione. Se attivati prima di quella fase, conservano comunque un set completo di geni.

Cellule staminali derivate da tali cellule attivate partenogeneticamente sarebbe improbabile che vengano rifiutati dopo il trapianto perché sarebbero molto simili alle cellule di un paziente e non produrrebbero molte molecole che sarebbero estranee al sistema immunitario delle persone. (Non sarebbero identiche alle cellule individuali a causa del mescolamento genico che si verifica sempre durante la formazione di ovuli e spermatozoi.) Tali cellule potrebbero anche sollevare meno dilemmi morali per alcune persone rispetto alle cellule staminali derivate da embrioni precoci clonati.

In uno scenario, una donna con malattie cardiache potrebbe raccogliere le proprie uova e attivarle in laboratorio per produrre blastocisti. Gli scienziati potrebbero quindi utilizzare combinazioni di fattori di crescita per indurre le cellule staminali isolate dalle blastocisti a diventare cellule muscolari cardiache che crescono in piastre di laboratorio che potrebbero essere reimpiantate nella donna per rattoppare unarea malata del cuore. Usare una tecnica simile, chiamata androgenesi, per creare cellule staminali per curare un uomo sarebbe più complicato. Ma potrebbe comportare il trasferimento di due nuclei dallo sperma delluomo in un uovo fornito che era stato privato del suo nucleo.

I ricercatori hanno precedentemente riferito di spingere le uova di topi e conigli a dividersi in embrioni esponendole a diverse sostanze chimiche. o stimoli fisici come una scossa elettrica. Già nel 1983, Elizabeth J. Robertson, che ora è allUniversità di Harvard, ha dimostrato che le cellule staminali isolate da embrioni di topo partenogenetico potrebbero formare una varietà di tessuti, inclusi nervi e muscoli.

Nei nostri esperimenti di partenogenesi, abbiamo esposto 22 uova a sostanze chimiche che hanno modificato la concentrazione di atomi carichi chiamati ioni allinterno delle cellule. Dopo cinque giorni di crescita in piastre di coltura, sei uova si erano sviluppate in quelle che sembravano essere blastocisti, ma contenevano in modo non chiaro la cosiddetta massa cellulare interna che produce cellule staminali.

Perché labbiamo fatto

SIAMO DISPONIBILI PER IL GIORNO in cui saremo in grado di offrire ai malati la clonazione terapeutica o la terapia cellulare derivante dalla partenogenesi. Attualmente i nostri sforzi sono concentrati sulle malattie del sistema nervoso e cardiovascolare e sul diabete, malattie autoimmuni e malattie che coinvolgono il sangue e il midollo osseo.

Una volta che saremo in grado di derivare cellule nervose da embrioni clonati, speriamo non solo di guarire il midollo spinale danneggiato, ma di curare disturbi cerebrali come il morbo di Parkinson, in cui la morte delle cellule cerebrali che producono una sostanza chiamata la dopamina porta a tremori incontrollabili e paralisi. Anche la malattia di Alzheimer, lictus e lepilessia potrebbero cedere a un tale approccio.

Oltre alle cellule delle isole pancreatiche che producono insulina per il trattamento del diabete, le cellule staminali degli embrioni clonati potrebbero anche essere spinte a diventare cellule del muscolo cardiaco come terapie per il cuore congestizio insufficienza, aritmie e tessuto cardiaco sfregiato da attacchi di cuore.

Unapplicazione potenzialmente ancora più interessante potrebbe comportare la stimolazione delle cellule staminali clonate a differenziarsi in cellule del sangue e del midollo osseo. Disturbi autoimmuni come la sclerosi multipla e lartrite reumatoide insorgono quando i globuli bianchi del sistema immunitario, che derivano dal midollo osseo, attaccano i tessuti del corpo. Studi preliminari hanno dimostrato che i malati di cancro che avevano anche malattie autoimmuni hanno ottenuto sollievo dai sintomi autoimmuni dopo aver ricevuto trapianti di midollo osseo per sostituire il proprio midollo che era stato ucciso dalla chemioterapia ad alte dosi per curare il cancro. Le infusioni di cellule staminali clonate ematopoietiche o ematopoietiche potrebbero “riavviare” il sistema immunitario delle persone con malattie autoimmuni.

Ma le cellule clonate o quelle generate attraverso la partenogenesi sono normali? Solo i test clinici delle cellule mostreranno alla fine se tali cellule sono sufficientemente sicure per luso di routine nei pazienti, ma i nostri studi sugli animali clonati hanno dimostrato che i cloni sono sani. Nel numero di Science del 30 novembre 2001, abbiamo riferito del nostro successo fino ad oggi con la clonazione del bestiame. Su 30 bovini clonati, sei sono morti poco dopo la nascita, ma il resto ha avuto risultati normali agli esami fisici e gli esami del loro sistema immunitario mostrano che non differiscono dal bestiame normale. Due delle mucche hanno persino dato alla luce vitelli sani.

Il processo di clonazione sembra anche ripristinare l “orologio dellinvecchiamento” nelle cellule clonate, in modo che le cellule appaiano in qualche modo più giovani delle cellule da cui provengono sono stati clonati. Nel 2000 abbiamo riportato che i telomeri, le calotte allestremità dei cromosomi dei vitelli clonati, sono lunghi quanto quelli dei vitelli di controllo. I telomeri normalmente si accorciano o vengono danneggiati con linvecchiamento dellorganismo. La clonazione terapeutica può fornire cellule “giovani” a una popolazione che invecchia.

Un rapporto dello scorso luglio di Rudolf Jaenisch del Whitehead Institute for Biomedical Research di Cambridge, Mass., E dei suoi colleghi ha ottenuto molta attenzione perché lo ha scoperto -dichiamati difetti di imprinting nei topi clonati. Limprinting è un tipo di timbro posto su molti geni nei mammiferi che cambia il modo in cui i geni vengono attivati o disattivati a seconda che i geni siano ereditati dalla madre o dal padre. Il programma di imprinting viene generalmente “resettato” durante lo sviluppo embrionale.

Sebbene limprinting sembri giocare un ruolo importante nei topi, nessuno sa ancora quanto sia significativo il fenomeno per gli esseri umani.Inoltre, Jaenisch e i suoi collaboratori non hanno studiato topi clonati da cellule prelevate dal corpo di adulti, come fibroblasti o cumuli. Invece hanno esaminato i topi clonati da cellule embrionali, che potrebbero essere più variabili. Gli studi che dimostrano che limprinting è normale nei topi clonati da cellule adulte sono attualmente in corso di stampa e dovrebbero essere pubblicati nella letteratura scientifica entro diversi mesi.

Nel frattempo stiamo continuando i nostri esperimenti di clonazione terapeutica per generare embrioni umani clonati o prodotti partenogeneticamente che produrranno cellule staminali. Gli scienziati hanno appena iniziato a sfruttare questa importante risorsa.

GLI AUTORI:

JOSE B. CIBELLI, ROBERT P. LANZA e MICHAEL D. WEST sono vicepresidente della ricerca, vicepresidente di sviluppo medico e scientifico, e presidente e CEO, rispettivamente, di Advanced Cell Technology, una società privata di biotecnologie a Worcester, Mass. Cibelli ha ricevuto il suo DVM dellUniversità di La Plata in Argentina e il suo dottorato di ricerca. dallUniversità del Massachusetts ad Amherst. La sua ricerca ha portato alla creazione dei primi vitelli geneticamente modificati clonati nel 1998. Lanza ha un M.D. presso lUniversità della Pennsylvania. È un ex studioso Fulbright ed è autore o editore di numerosi libri divulgativi e scientifici, tra cui il testo Principles of Tissue Engineering. West ha conseguito un dottorato di ricerca. dal Baylor College of Medicine ed è particolarmente interessato allinvecchiamento e alle cellule staminali. Dal 1990 al 1998 è stato fondatore, direttore e vicepresidente della Geron Corporation a Menlo Park, in California, dove ha avviato e gestito programmi di ricerca sulla biologia dei telomeri (le estremità dei cromosomi, che si restringono durante linvecchiamento) e lo sforzo di derivare cellule staminali embrionali umane. Carol Ezzell è una scrittrice ed editrice.

ALTRO DA ESPLORARE:

Prospects for the Use of Nuclear Transfer in Human Transplantation.Robert P. Lanza, Jose B. Cibelli e Michael D West in NatureBiotechnology, vol. 17, n. 12, pagine 11711174; Dicembre 1999.

La validità etica dellutilizzo del trasferimento nucleare nei trapianti umani. Robert P. Lanza et al. in Journal of the American Medical Association, vol. 284, n. 24; 27 dicembre 2000.

The Human Embryo Research Debates: Bioethics in the Vortex ofControversy. Ronald M. Green. Oxford University Press, 2001.

Il testo completo del nostro articolo su e-biomed: The Journal of Regenerative Medicine può essere visualizzato su www.liebertpub.com/ebi