Comprensione dello sviluppo e della funzione delle cellule T helper follicolari

Lattivazione ingenua delle cellule T e la differenziazione funzionale sono attivate dal sistema immunitario innato. In risposta ai patogeni, le cellule dendritiche (DC) sovraregolano le molecole costimolatorie per aiutare ad innescare le cellule T antigene-specifiche. Inoltre, gli APC secernono anche più citochine che regolano la differenziazione terminale delle cellule T in cellule T effettrici. Studi recenti hanno stabilito ruoli critici per le molecole costimolatorie e alcune citochine nella differenziazione delle cellule Tfh (Figura 2).

Costimolazione

Lattivazione delle cellule T è regolata da molecole costimolatorie. Il CD28, che è espresso sui linfociti T naive, è il più importante recettore costimolatorio coinvolto nellattivazione dei linfociti T.28 In assenza di CD28 o dei suoi ligandi CD80 e CD86, la differenziazione delle cellule Th in tutte le linee è stata trovata significativamente ridotta. La costimolazione del CD28 è essenziale anche per lo sviluppo delle cellule Tfh, quindi i topi con deficit di CD28 sono collegati alla mancata sovraregolazione di CXCR5 e OX40 sui linfociti T e alla formazione del centro germinale interrotto.17 Tuttavia, le risposte mediate da CD28, la generazione di cellule Tfh e la formazione del centro diventa indipendente da CD28 e dipendente da ICOS quando lubiquitina ligasi Roquin E3 è mutata.29

ICOS appartiene alla famiglia CD28 ed è espressa sui linfociti T attivati.30, 31 mentre il suo ligando, B7h, è ampiamente espresso sulle APC nei tessuti non linfoidi.32, 33 Linterazione ICOS-B7h è necessaria per lattivazione ottimale dei linfociti T nonché per alcune funzioni effettrici, come lespressione di IL-4 e IL-17.34, 35, 36, 37, 38 Inoltre, ICOS svolge un ruolo importante nella regolazione delle risposte anticorpali dipendenti dalle cellule T e delle reazioni del centro germinale. I topi carenti di ICOS o B7h mostrano una ridotta formazione del centro germinale e commutazione dellisotipo.34, 35, 36, 37, 39 Recentemente, questo percorso costimolatorio si è rivelato importante anche per la generazione e il mantenimento delle cellule CXCR5 + Tfh. Più specificamente, i topi con deficit di ICOS hanno mostrato uno sviluppo alterato delle cellule CXCR5 + Tfh in risposta allimmunizzazione primaria o secondaria con globuli rossi di pecora.6 Nel frattempo, lablazione di B7h su APC ha determinato una diminuzione dellespressione di IL-21 da parte delle cellule T. è stato anche dimostrato che ICOS è altamente espresso dalle cellule T tonsillari umane CXCR5 + allinterno della zona chiara dei centri germinali e supporta in modo efficiente la produzione di immunoglobuline.40,41 Inoltre, la carenza di ICOS negli esseri umani e nei topi ha determinato un numero sostanzialmente ridotto di cellule Tfh e profondi difetti Maturazione delle cellule B e commutazione dellisotipo dellimmunoglobulina, indicando un ruolo essenziale per ICOS nella differenziazione delle cellule Tfh.11, 19 È interessante notare che una mutazione nellubiquitina ligasi E3 di tipo RING Roquin nei topi ha provocato la formazione spontanea del centro germinale e una maggiore produzione di autoanticorpi , che è associato con un numero notevolmente aumentato di cellule Tfh e una migliore espressione di IL-21 e ICOS.13

Poiché B7h è con espresso in modo affidabile sui linfociti B, abbiamo esaminato se la generazione di cellule Tfh richiedesse uninterazione affine tra linfociti B e T.24 Lanalisi di un topo knockout condizionale carente nellespressione delle cellule B di B7h ha rivelato che lassenza del ligando ICOS dalle cellule B porta a ridotta frequenza delle cellule Tfh. Oltre alla minore espressione di CXCR5, abbiamo scoperto che lespressione di IL-21 da parte delle cellule T era notevolmente ridotta in questi topi. Linterazione ICOS-B7h può quindi regolare le cellule Tfh tramite la produzione di IL-21. Abbiamo anche osservato che la produzione di IgG antigene-specifiche e lagglutinina di arachidi (PNA) + le cellule B del centro germinale erano notevolmente ridotte in assenza di espressione di B7h sulle cellule B. I nostri dati indicano quindi che lespressione di B7h sulle cellule B è necessaria per la generazione di cellule CXCR5 + Tfh, nonché per la produzione di IL-21 e risposte anticorpali appropriate, suggerendo unimportante funzione in vivo per le cellule B nella generazione o nel mantenimento delle cellule Tfh .

Tutte le osservazioni precedenti suggeriscono che i difetti nello sviluppo delle cellule Tfh e nella formazione del centro germinale nei topi e nei pazienti con deficit di ICOS possono essere dovuti in parte alla produzione difettosa di IL-21, che di solito agisce come un autocrino fattore che espande la popolazione di cellule Tfh. In effetti, il numero di cellule Tfh è stato ridotto nei topi carenti di IL-21. Un recente studio ha presentato prove che ICOS promuove la formazione di cellule Tfh attraverso la sovraregolazione dellespressione di c-Maf, che ha migliorato lespressione di IL-21 in modo dose-dipendente.42 Pertanto, lespressione di c-Maf indotta da ICOS può supportare la formazione e il mantenimento delle cellule Tfh tramite produzione del fattore di crescita autocrino IL-21.

SAP è espresso nelle cellule T e media le risposte ai membri della famiglia SLAM legandosi a un dominio conservato su quei recettori. La famiglia di recettori SLAM è composta da sette membri: CD150 / SLAM, CD48 / SLAMF2, CD229 / Ly9 / SLAMF3, CD224 / 2B4 / SLAMF4, CD84 / SLAMF5, NTB-A / Ly108 / SLAMF6 e CD319 / CRACC / SLAMF7.La mutazione di SAP negli esseri umani, così come gli studi che hanno coinvolto topi con deficit di SAP, hanno suggerito un ruolo critico per SAP nellaiuto delle cellule B e nel cambio di classe nelle cellule Th.43 Da notare, le cellule T con deficit di SAP hanno mostrato unespressione di ICOS ritardata e ridotta ma espressione di CD40L elevata e prolungata.44 Anche le cellule T CD4 + con deficit di SAP non riescono a interagire stabilmente con le cellule B affini, non riuscendo quindi a indurre lespansione clonale delle cellule B.45 Tuttavia, queste cellule T carenti esprimono ancora livelli normali di CXCR5. SAP svolge quindi un ruolo chiave nella formazione mediata da cellule Tfh dei centri germinali dopo aver incontrato una cellula B affine, piuttosto che regolare la migrazione delle cellule Tfh.

CD84 / SLAMF5 e Ly108 / SLAMF6 sono altamente espressi nelluomo e cellule Tfh di topo.46, 47 Usando topi con deficit di CD84, Cannons et al.hanno dimostrato che il CD84 è necessario per la formazione del centro germinale e la differenziazione delle cellule Tfh in vivo in modo intrinseco alle cellule T.47 Pertanto, lasse CD84-SAP è probabilmente il percorso canonico nelle cellule T CD4 + che media lo sviluppo e la funzione delle cellule Tfh.

Citochine

Le citochine sono i principali regolatori della differenziazione delle cellule Th.1, 3 La differenziazione Th1 è promossa da IL -12 attraverso lattivazione di STAT4. La via IFN-γ-STAT1 a sua volta sostiene lo sviluppo delle cellule Th1, portando allinduzione del fattore di trascrizione T-bet. Nel frattempo, IL-4 viene secreta dalle cellule T attivate e guida la polarizzazione Th2 in un modo dipendente da STAT6, con conseguente attivazione del fattore di trascrizione GATA3 Inoltre, IL-6 / IL-21, in combinazione con TGF-β, induce la differenziazione delle cellule Th17 tramite la sovraregolazione di RORγ dipendente da STAT3. Questa differenziazione delle cellule Tfh mediata dalle citochine, tuttavia, varia tra i topi e gli esseri umani.

IL-21

IL-21 svolge un ruolo critico nella regolazione della produzione di immunoglobuline e nella formazione del centro germinale. 12, 48 Questo recettore delle citochine appartiene alla famiglia delle catene γ comune, che comprende anche i recettori per IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15. Segnali di IL-21 tramite STAT3 o STAT5a per regolare le funzioni di una varietà di tipi di cellule, come i linfociti T, i linfociti B, i linfociti natural killer e le DC, ed è espresso principalmente dai linfociti T CD4 + e dai linfociti T natural killer.49 In precedenza, era stato anche riferito che IL- 21 è espresso a livelli più alti da Th2 rispetto alle cellule Th1.50 In questultimo caso, laggiunta di IL-21 durante il differenziamento diminuisce la produzione di IFN-γ reprimendo lespressione di Eomes.51 È stato anche osservato che IL-21 è indotta da IL-6 per mezzo di STAT3, e in combinazione con TGF-β, è necessaria e sufficiente per la generazione di cellule Th17 tramite la sovraregolazione di RO dipendente da STAT3 Rγ.52, 53, 54 Sia i topi carenti di IL-21 che IL-21R sono difettosi nello sviluppo delle cellule Th17, suggerendo che IL-21 agisce in modo autocrino, proprio come IFN-γ fa per le cellule Th1 e IL-4 fa per le cellule Th2.

Inoltre, lo sviluppo del centro germinale è compromesso nei topi carenti di IL-21 e IL-21R.12 In questo contesto, come maggiori produttori di IL-21 rispetto a Th1, Th2 e sottoinsiemi Th17, le cellule Tfh hanno un impatto benefico sullinterruttore della classe di anticorpi e sulla formazione del centro germinale. Due gruppi hanno recentemente evidenziato il ruolo di IL-21 nella generazione di cellule Tfh e cellule B del centro germinale.24, 55 Limmunizzazione di topi carenti di IL-21 con un antigene dipendente dalle cellule T ha determinato una drastica riduzione di CD4 + CXCR5 + cellule T, suggerendo che IL-21 agisce come un modo autocrino durante lo sviluppo delle cellule Tfh.24 Oltre alle cellule Tfh, sono stati osservati un numero significativamente ridotto di cellule B del centro germinale e una ridotta produzione di IgG1 nei topi immunizzati con deficit di IL-21 . Vogelzang et al. hanno dimostrato che quei difetti erano linfociti T, piuttosto che linfociti B intrinseci.55

È stato dimostrato che IL-21 è indotta da IL-6 in modo dipendente da STAT3.24 Tuttavia, a differenza di Th17 cellule, la generazione di cellule Tfh era indipendente dal TGF-β o dai recettori nucleari orfani specifici per Th17 RORα e RORγ.24 Inoltre, abbiamo dimostrato che le cellule Th che producono IL-21 possono essere generate in vitro in presenza di IL-21 ma non TGF-β, e che queste cellule acquisiscano il profilo di espressione genica Tfh.24 Il trasferimento di queste cellule Tfh-simili generate in vitro e che producono IL-21 in topi ingenui ha facilitato la funzione dei linfociti B, simile alle cellule Tfh. Nel complesso, questi risultati confermano lidentità delle cellule Tfh come una linea Th separata e suggeriscono che IL-21 è importante per la generazione di cellule Tfh e le reazioni del centro germinale nei topi.

IL-12

Nonostante i progressi nella caratterizzazione dei meccanismi alla base dello sviluppo delle cellule Tfh murine, la regolazione dello sviluppo delle cellule Tfh umane è rimasta poco chiara fino a tempi recenti. Due studi indipendenti hanno dimostrato che IL-12 induce la generazione in vitro di cellule umane Tfh-simili da cellule T CD4 + naive.46, 56 cellule Tfh che si differenziano sotto linfluenza di IL-12 condividono caratteristiche chiave con le cellule Tfh trovate nei tessuti linfoidi periferici, inclusa la produzione di IL-21, lespressione sostenuta di ICOS e CXCR5 e la capacità di assistere la differenziazione delle cellule B in immunoglobuline- cellule secernenti. È interessante notare che lesposizione a IL-12 (condizioni Th1) di cellule T tonsillari, sangue del cordone o sangue periferico adulto ha causato un aumento significativo dellespressione di IL-21, mentre IL-21, IL-6 e IL-23 hanno indotto la secrezione di IL-21 in misura minore.46 Schmitt et al. hanno dimostrato che IL-12 innesca alti livelli di produzione di IL-21 tramite lattivazione di STAT4, mentre IL-21 e IL-23 inducono una minore produzione di IL-21 nelle cellule T CD4 + umane.56 È stato anche osservato che IL-12 indotta da IL- Le cellule produttrici di 21 includevano i sottoinsiemi IFN-γ + e IFN-γ-.

Non è chiaro se lattivazione autocrina di IL-21 e STAT3 abbia un ruolo nella differenziazione dellIL-21 indotta da IL-12 -produzione di cellule Th negli esseri umani. È interessante notare che Ma et al. hanno dimostrato che le cellule IFN-γ + IL-21− e IFN-γ + IL-21 + esprimono alti livelli di T-bet, mentre la generazione di cellule IFN-γ − IL-21 + è altamente dipendente dallespressione di Bcl6.46 Inoltre, Le cellule T CD4 + naive umane coltivate in presenza di IL-12 esprimono alti livelli di CXCR5, che possono essere importanti per la localizzazione di queste cellule nei follicoli delle cellule B. Oltre allespressione di CXCR5, il trattamento con IL-12 ha anche aumentato i livelli di espressione di ICOS. Ancora più importante, le cellule in vitro innescate da IL-12, secernenti IL-21 hanno indotto una secrezione significativamente maggiore di immunoglobuline da parte dei linfociti B naive. Questo effetto dipendeva dalla segnalazione di IL-21 e ICOS ma non dallIFN-γ. Pertanto, le cellule T ICOS + CXCR5 + CD4 + umane generate in vitro in presenza di IL-12 condividono caratteristiche fenotipiche e funzionali con le cellule Tfh. IL-21 e IL-12 sono quindi necessari per lo sviluppo di cellule Tfh murine e umane, rispettivamente.

IFN di tipo I

Gli IFN di tipo I rappresentano una famiglia di citochine con proprietà antivirali e funzioni immunomodulatorie.57 Sottotipi multipli di IFN-α e un singolo sottotipo IFN-β sono rapidamente indotti in risposta a infezioni e segnali attraverso un recettore IFN-α comune.57 È stato dimostrato che questi IFN aumentano potentemente la risposta anticorpale primaria a un solubile antigene proteico, aumentando la produzione di tutte le sottoclassi di IgG.58, 59 Inoltre, gli IFN di tipo I hanno promosso risposte anticorpali quando le DC di tipo selvaggio sono state trasferite a topi con deficit del recettore IFN-α, fornendo una prova diretta che la stimolazione di tipo I-IFN delle DC migliorare la risposta immunitaria in vivo.58, 59

Un recente studio ha rivelato che la segnalazione di tipo I-IFN nelle DC stimola selettivamente lo sviluppo delle cellule Tfh in risposta allantigene legato al recettore Toll-like 3 o 4 agonisti.60 Inoltre, la produzione di DC di IL-6 è necessaria per Tfh in vivo generazione di cellule e maturazione dellaffinità degli anticorpi. Pertanto, gli IFN di tipo I migliorano le risposte anticorpali dipendenti dalle cellule T fungendo da adiuvante naturale per la generazione di cellule CXCR5 + Tfh residenti nei linfonodi. Resta da determinare quale sottoinsieme DC regola la generazione di cellule Tfh.

I pazienti con lupus eritematoso sistemico (LES) hanno aumentato i livelli di IFN-α, che è correlato alla gravità della malattia.61 Inoltre, studi in vari ceppi di topi inclini al lupus hanno rivelato il ruolo critico degli IFN di tipo I nella patologia simile al lupus.62, 63, 64 Un numero maggiore di cellule Tfh è stato osservato anche nei modelli murini di SLE, 6, 65 dove sono necessari per il lupus -like patologia.66 Tuttavia, la generazione di cellule Tfh dipendente da IFN di tipo I durante una risposta autoimmune non è stata ancora affrontata e richiede ulteriori indagini.

Fattori di trascrizione

La differenziazione di ingenuo Le cellule T CD4 + in diversi lignaggi sono determinate dalla segnalazione delle citochine e dalla successiva attivazione di fattori di trascrizione specifici (Figura 1). Ad esempio, la segnalazione IFN-γ / IL-12 tramite STAT1 / STAT4 regola la trascrizione T-bet nelle cellule Th1, 67 mentre la segnalazione IL-4 attraverso STAT6 attiva lespressione GATA3 nelle cellule Th2.68 IL-6 e IL-21 agiscono entrambi tramite STAT3, che porta alla sovraregolazione dellespressione dei due recettori nucleari orfani specifici per Th17 RORγ e RORα, che alla fine determinano la differenziazione terminale delle cellule Th17.3 Per la differenziazione delle cellule Tfh è stato dimostrato che nessuno dei due specifici Th1 (STAT4, T-bet ) né fattori di trascrizione selettivi per Th2 (STAT6, GATA3) .24 Nonostante il fatto che entrambe le linee Th17 e Tfh richiedano IL-6 / IL-21 e STAT3, lo sviluppo delle cellule Tfh non richiede fattori di trascrizione correlati a Th17 (RORα e RORγ). Piuttosto, Bcl6 è il principale regolatore trascrizionale della differenziazione delle cellule Tfh.

STAT3

È stato riportato che IL-21 è necessaria per la differenziazione delle cellule Tfh24 ed è indotta nei linfociti T da IL- 6 in modo dipendente da STAT3.52 Per determinare se la segnalazione STAT3 è necessaria per lo sviluppo delle cellule Tfh, Nurieva et al. ha analizzato la generazione di cellule Tfh in topi Stat3f / f incrociati con topi CD4-cre.24 Limmunizzazione di questi topi con emocianina della patella del buco della serratura nelladiuvante completo di Freund ha rivelato una grande riduzione delle cellule CXCR5 + Tfh in assenza di STAT3. Inoltre, il deficit di STAT3 nelle cellule T ha portato alla generazione di cellule B del centro germinale difettoso e alla ridotta Keyhole limpet emocianina-specifiche IgG e IgM. Pertanto, STAT3 gioca un ruolo importante nella differenziazione delle cellule Tfh.

Bcl6

Il fattore di trascrizione Bcl6 è espresso selettivamente dalle cellule Tfh murine e umane. 69, 70 È stato precedentemente dimostrato che inibisce le risposte Th2 bloccando il legame di STAT6 al DNA, 71, 72 mentre i topi carenti di Bcl6 presentano malattie infiammatorie multiorgano, maggiore produzione di IgE e reazioni del centro germinale difettoso.71, 73 Tuttavia, non era chiaro se il difetto del centro germinale in questi topi fosse causato da una mancanza di una corretta funzione dei linfociti T e / o B poiché anche i linfociti B del centro germinale esprimono Bcl6.74 Recentemente, il nostro gruppo e altri hanno dimostrato che il fattore di trascrizione Bcl6 è un maestro r egulatore della differenziazione delle cellule Tfh.25, 26, 27

Lespressione di Bcl6 è indotta da IL-6 e IL-21 e la sovraespressione di Bcl6 promuove lo sviluppo delle cellule Tfh in assenza di citochine esogene.25 La sovraespressione di Bcl6 porta anche allaumentata espressione dellmRNA endogeno di Bcl6 e di IL-21R, IL-6R e CXCR5, come nel caso delle cellule trattate con IL-6 o IL-21. È interessante notare che lespressione di IL-21 non è stata sovraregolata dalla sovraespressione di Bcl6. Inoltre, lespressione di Bcl6 non era richiesta per lo sviluppo delle cellule Th1, Th2 o Th17 e, infatti, la sovraespressione di Bcl6 reprimeva la produzione di citochine Th1, Th2 e Th17.25

La funzione di Bcl6 sembra dipendere dal DNA 25,26 Si lega ai promotori dei regolatori trascrizionali T-bet e RORγt, che determinano rispettivamente il destino delle cellule Th1 e Th17, determinando la repressione della produzione di IFN-γ e IL-17.26 Inoltre, Bcl6 sopprime espressione di microRNA che si ritiene inibiscano la firma delle cellule Tfh, incluso miR-17-92, che reprime lespressione di CXCR5. Pertanto, Bcl6 regola lo sviluppo delle cellule Tfh tramite la repressione dei fattori di trascrizione specifici di Th1, Th2 e Th17. La carenza di Bcl6 nei linfociti T ha provocato un alterato sviluppo delle cellule Tfh sia in vitro che in vivo, e la carenza di entrambe le cellule B e T è necessaria per le reazioni del centro germinale.25, 26, 28

Prese insieme, queste i risultati dimostrano che Bcl6 è sia necessario che sufficiente per lo sviluppo delle cellule Tfh e forniscono ulteriori prove a sostegno dellidea che le cellule Tfh siano una stirpe distinta di cellule Th.

c-Maf

c- Il Maf è stato il primo fattore di trascrizione identificato ad essere espresso preferenzialmente nelle cellule Th2.75 Si lega al promotore prossimale dellIL-475 e funge da fattore Th2-specifico. Le cellule T carenti di c-Maf erano alterate nellespressione di IL-4 durante la fase effettrice, mentre lespressione di altre citochine Th2 era moderatamente ridotta o inalterata.76 In precedenza, utilizzando topi con deficit di ICOS e B7h, Dong et al. hanno descritto i meccanismi mediante i quali ICOS media la produzione di IL-4 regolando lespressione di c-Maf nelle cellule Th effettrici.36,77 Lungo queste linee, il fenotipo dei topi knockout di c-Maf è simile a quello dei topi con deficit di ICOS. Inoltre, la sovraespressione di c-Maf ripristina il rilascio di IL-4 da parte delle cellule T attivate in assenza dellinterazione ICOS-B7h. Oltre alla produzione difettosa di IL-4, i topi con deficit di ICOS e B7h sono compromessi nella generazione di cellule Tfh e nella produzione di IL-21.24 Kuchroo et al. recentemente hanno dimostrato che le cellule Tfh sono caratterizzate da unelevata espressione di c-Maf e che c-Maf ha aumentato i livelli di IL-21 in modo dose-dipendente.42 Nel frattempo, la delezione di c-Maf ha portato a un numero ridotto di Tfh che esprimono IL-21 42 ICOS regola quindi la differenziazione delle cellule Tfh che producono IL-21 tramite la sovraregolazione dellespressione di c-Maf.

Fattore regolatore IFN 4 (IRF4)

IRF4 è stato originariamente descritto come un fattore di trascrizione specifico per Th2, 78, 79 in parte poiché i topi con deficit di IRF4 mostrano livelli significativamente ridotti di immunoglobulina sierica.80 Tuttavia, studi recenti hanno rivelato che questo fattore di trascrizione è indotto dalla segnalazione di IL-1 ed è necessario per la differenziazione delle cellule Th17 .81, 82 cellule T carenti di IRF4, daltra parte, non riescono a indurre il lignaggio Th17 su stimolazione IL-21 e TGF-β.83 Inoltre, le cellule T prive di proteina legante IRF4, un antagonista naturale di IRF4, mostrano elevate Produzione di IL-21.84 IRF4 è quindi fondamentale per la produzione di IL-21 e per IL-2 Differenziazione delle cellule Th mediata da 1.

Dati questi risultati, sembra che IRF4 possa anche svolgere un ruolo nella differenziazione delle cellule Tfh. Infatti, i topi carenti di IRF4 generano meno cellule CXCR5 + ICOS + Tfh al momento dellimmunizzazione, 85 indicando limportanza di IRF4 durante la differenziazione delle cellule Tfh in vivo. Resta da determinare se la generazione di cellule Tfh dipendente da IRF4 è intrinseca delle cellule T e se IRF4 regola la proteina di maturazione indotta dai linfociti Bcl6 e B (Blimp-1) durante lo sviluppo del lignaggio Tfh.

Regolazione negativa

La differenziazione delle cellule Tfh è regolata da un programma che antagonizza lo sviluppo di altri lignaggi Th sopprimendo i fattori di trascrizione specifici del lignaggio (T-bet, GATA3 e RORγ). Tuttavia, non è stato riportato se questi fattori regolano negativamente anche la differenziazione delle cellule Tfh. Il Blimp-1, precedentemente descritto come antagonizzante Bcl6 nei linfociti B, 86 è significativamente ridotto nei linfociti Tfh rispetto ai linfociti T CD4 + non Tfh.27 La sovraespressione del Blimp-1 nelle cellule T CD4 + impedisce quindi lespressione differenziazione delle cellule Tfh, senza influenzare lo sviluppo delle cellule Th2, Th17 e Treg. Inoltre, le cellule T CD4 + con deficit di Blimp-1 hanno mostrato una migliore differenziazione nella linea Tfh.27