Dalším krokem bylo získat ženy ochotné přispět vajíčky, která se mají použít při klonování, a také sbírat buňky od jednotlivců, kteří mají být klonováni (dárci). Klonovací proces se zdá být jednoduchý, ale úspěch závisí na mnoha malých faktorech, z nichž některé dosud nerozumí. V základní technice přenosu jader vědci používají extrémně jemnou jehlu k odsávání genetického materiálu ze zralého vajíčka. Poté vstříknou jádro dárcovské buňky (nebo někdy celé buňky) do enukleovaného vajíčka a inkubují za zvláštních podmínek, které ji vedou k rozdělení a růstu.

Zjistili jsme, že ženy jsou ochotny anonymně přispět vajíčky pro použití v našem výzkumu umístěním reklamy do publikací v oblasti Bostonu . Přijali jsme ženy pouze ve věku 24 až 32 let, které měly alespoň jedno dítě. Je zajímavé, že náš návrh oslovil jinou podskupinu žen než ty, které by jinak mohly přispět vajíčky neplodným párům pro použití při oplodnění in vitro. Ženy, které odpověděly na naše reklamy, byly motivovány dát svá vajíčka k výzkumu, ale mnoho by nemělo zájem o to, aby jejich vajíčka byla použita ke generování dítěte, které by nikdy neviděli. (Dárci byli přijati a vajíčka sbíral tým vedený Ann A. Kiessling-Cooper z Duncan Holly Biomedical v Somerville, Massachusetts. Kiessling byl také součástí jednání týkajících se etických otázek souvisejících s přispěvateli vajec.)

Požádali jsme potenciální přispěvatele vajec, aby se podrobili psychologickým a fyzickým testům, včetně screeningu na infekční nemoci, abychom zajistili, že ženy budou zdravé a přispívající vajíčka na ně nebudou mít nepříznivý vliv. Nakonec jsme skončili s 12 ženami, které byly dobrými kandidátky, aby přispěly vejci. Mezitím jsme odebrali kožní biopsie od několika dalších anonymních jedinců, abychom izolovali buňky zvané fibroblasty pro použití při klonování. Naše skupina dárců fibroblastů zahrnuje lidi různého věku, kteří jsou obecně zdraví nebo mají poruchu, jako je cukrovka nebo poranění míchy, druhy lidí, kteří mohou mít prospěch z terapeutického klonování.

Náš první pokus o klonování proběhl loni v červenci . Načasování každého pokusu záviselo na menstruačních cyklech žen, které přispěly vajíčky; dárci museli užívat hormonální injekce několik dní, aby ovulovali 10 nebo více vajíček najednou namísto normálního jednoho nebo dvou.

Třetí cyklus pokusů, kdy Zdálo se, že jádro injikovaného fibroblastu se dělí, ale nikdy se neštěpilo a vytvořilo dvě odlišné buňky. V příštím cyklu jsme se tedy rozhodli vzít směr, který použil Teruhiko Wakayama a jeho kolegové, vědci, kteří vytvořili první klonované myši v roce 1998. (Wakayama byl tehdy na Havajské univerzitě a nyní je na Advanced Cell Technology.) injikovali jsme některým vajíčkům jádra z kožních fibroblastů jako obvykle, jiným jsme injekčně podali ovariální buňky zvané kumulované buňky, které obvykle vyživují vyvíjející se vajíčka ve vaječníku a které lze zjistit, že se po ovulaci stále drží na vejcích. Buňky kupy jsou tak malé, že je lze injikovat celé. Nakonec trvalo celkem 71 vajec od sedmi dobrovolníků, než jsme mohli vygenerovat naše první klonované rané embryo. Z osmi vajec, kterým jsme injekčně podali buňky kupy, se dvě rozdělila, aby vytvořila časná embrya čtyř buněk, a jedno postupovalo do nejméně šesti buněk, než se růst zastavil.

Partenogeneze

TAKÉ SE NACHÁZÍME STANOVIT, zda mohli bychom přimět lidská vejce, aby se rozdělila na časná embrya, aniž by byla oplodněna spermatem nebo byla enukleována a injikována dárcovskou buňkou. Ačkoli zralá vajíčka a spermie mají normálně pouze polovinu genetického materiálu typické tělesné buňky, aby se zabránilo embryu, aby po početí mělo dvojí sadu genů, vejce sníží svůj genetický doplněk na polovinu relativně pozdě ve svém cyklu zrání. Pokud je aktivován před touto fází, stále si uchovávají celou sadu genů.

Kmenové buňky odvozené z těchto parthenogeneticky aktivovaných buněk je nepravděpodobné, že by byly po transplantaci odmítnuty, protože by se velmi podobaly pacientovým vlastním buňkám a neprodukovaly by mnoho molekul, které by byly imunnímu systému osob neznámé. (Nebyly by identické s buňkami jednotlivců kvůli přeskupení genů, ke kterému vždy dochází při tvorbě vajíček a spermií.) Takové buňky by také mohly u některých lidí vyvolat méně morálních dilemat, než jaké by kmenové buňky pocházely z klonovaných časných embryí.

Podle jednoho scénáře může být ženě se srdečním onemocněním odebráno a aktivováno vlastní vajíčko v laboratoři za vzniku blastocyst. Vědci by pak mohli použít kombinace růstových faktorů k přemoci kmenových buněk izolovaných z blastocyst, aby se staly buňkami srdečního svalu rostoucími v laboratorních miskách, které by mohly být implantovány zpět do ženy, aby opravily nemocnou oblast srdce. Použití podobné techniky, nazývané androgeneze, k vytvoření kmenových buněk k léčbě člověka by bylo složitější. Může to ale zahrnovat přenos dvou jader ze spermatu člověka do vajíčka, kterému bylo odebráno jádro.

Vědci již dříve uváděli, že je nutné vajíčka myší a králíků rozdělit na embrya vystavením různým chemikáliím nebo fyzické podněty, jako je elektrický šok. Již v roce 1983 Elizabeth J. Robertson, která je nyní na Harvardově univerzitě, prokázala, že kmenové buňky izolované z partenogenetických myších embryí mohou tvořit různé tkáně, včetně nervů a svalů.

V našich partenogenetických experimentech vystavili jsme 22 vajec chemikáliím, které změnily koncentraci nabitých atomů nazývaných ionty uvnitř buněk. Po pěti dnech pěstování v kultivačních miskách se ze šesti vajec vyvinuly blastocysty, které však zjevně neobsahovaly takzvanou vnitřní buněčnou hmotu, která poskytuje kmenové buňky.

Proč jsme to udělali

JSME DENNÍM DENEM, kdy budeme moci nemocným pacientům nabídnout terapeutické klonování nebo buněčnou terapii vyplývající z partenogeneze. V současné době se naše úsilí zaměřuje na nemoci nervového a kardiovaskulárního systému a na cukrovku, autoimunitní poruchy a nemoci zahrnující krev a kostní dřeň.

Jakmile dokážeme odvodit nervové buňky z klonovaných embryí, doufáme, že nejen vyléčíme poškozené míchy, ale že budeme léčit mozkové poruchy, jako je Parkinsonsova choroba, při které dochází k odumírání mozkových buněk, které tvoří látku zvanou dopamin vede k nekontrolovatelným třesům a paralýze. Alzheimerova choroba, cévní mozková příhoda a epilepsie také tomuto přístupu umožňují.

Kromě buněk pankreatických ostrůvků produkujících inzulín pro léčbu cukrovky by se také mohly stát kmenovými buňkami z klonovaných embryí buňky srdečního svalu jako terapie městnavého srdce selhání, arytmie a srdeční tkáň zjizvená infarkty.

Potenciálně ještě zajímavější aplikace by mohla zahrnovat výzvu klonovaných kmenových buněk k diferenciaci na buňky krve a kostní dřeně. Autoimunitní poruchy, jako je roztroušená skleróza a revmatoidní artritida, vznikají, když bílé krvinky imunitního systému, které vznikají z kostní dřeně, napadají vlastní tkáně těla. Předběžné studie ukázaly, že pacienti s rakovinou, kteří také měli autoimunitní onemocnění, získali úlevu od autoimunitních příznaků poté, co dostali transplantaci kostní dřeně, aby nahradili vlastní kostní dřeň, která byla zabita vysokodávkovanou chemoterapií k léčbě rakoviny. Infuze krvetvorných nebo hematopoetických klonovaných kmenových buněk mohou „restartovat“ imunitní systém lidí s autoimunitními chorobami.

Jsou však klonované buňky nebo ty generované partenogenezí normální? Pouze klinické testy buněk nakonec ukážou, zda jsou takové buňky dostatečně bezpečné pro rutinní použití u pacientů, ale naše studie klonovaných zvířat ukázaly, že klony jsou zdravé. V časopise Science z 30. listopadu 2001 jsme informovali o našem dosavadním úspěchu s klonováním dobytka. Z 30 klonovaných kusů skotu zemřelo šest krátce po narození, ale zbytek měl normální výsledky při fyzikálních zkouškách a testy jejich imunitního systému ukazují, že se neliší od běžného skotu. Dvě z krav dokonce porodily zdravá telata.

Zdá se, že proces klonování také resetuje „hodiny stárnutí“ v klonovaných buňkách, takže buňky vypadají v některých ohledech mladší než buňky, z nichž pocházejí byly klonovány. V roce 2000 jsme uvedli, že telomery čepice na koncích chromozomů od klonovaných telat jsou stejně dlouhé jako čepice od kontrolních telat. Telomery se obvykle stárnou organismus zkracují nebo jsou poškozeny. Terapeutické klonování může poskytnout „mladé“ buňky stárnoucí populaci.

Zpráva loni v červenci Rudolfa Jaenischa z Whitehead Institute for Biomedical Research v Cambridge ve státě Massachusetts a jeho kolegů získala velkou pozornost, protože zjistila, že zvané otisky vad u klonovaných myší. Otisk je typ razítka umístěného na mnoha genech u savců, který mění způsob zapnutí nebo vypnutí genů v závislosti na tom, zda jsou geny zděděny od matky nebo otce. Program imprintingu se během embryonálního vývoje obvykle „resetuje“.

Ačkoli se zdá, že imprinting hraje u myší důležitou roli, zatím nikdo neví, jak významný je tento jev pro člověka.Jaenisch a jeho spolupracovníci navíc nestudovali myši klonované z buněk odebraných z těl dospělých, jako jsou fibroblasty nebo buňky kupy. Místo toho zkoumali myši klonované z embryonálních buněk, u nichž se dalo očekávat, že budou variabilnější. Studie ukazující, že otisky jsou u myší klonovaných z dospělých buněk normální, jsou v současné době v tisku a měly by být publikovány ve vědecké literatuře během několika měsíců.

Mezitím pokračujeme v terapeutických klonovacích experimentech, abychom generovali klonovaná nebo parthenogeneticky vyrobená lidská embrya, která poskytnou kmenové buňky. Vědci teprve začali využívat tento důležitý zdroj.

AUTORI:

JOSE B. CIBELLI, ROBERT P. LANZA a MICHAEL D. WEST jsou viceprezidentem pro výzkum, viceprezidentem pro lékařský a vědecký vývoj a prezident a generální ředitel společnosti Advanced Cell Technology, soukromé biotechnologické společnosti ve Worcesteru v Massachusetts. Cibelli získal DVM z University of La Plata v Argentině a jeho Ph.D. z University of Massachusetts v Amherstu. Jeho výzkum vedl k vytvoření prvních klonovaných geneticky modifikovaných telat v roce 1998. Lanza má titul M.D. z University of Pennsylvania. Je bývalým Fulbrightovým učencem a je autorem nebo editorem mnoha populárních a vědeckých knih, včetně textu Principles of Tissue Engineering. West je držitelem titulu Ph.D. z Baylor College of Medicine a zajímá se zejména o stárnutí a kmenové buňky. Od roku 1990 do roku 1998 byl zakladatelem, ředitelem a viceprezidentem společnosti Geron Corporation v Menlo Park v Kalifornii, kde inicioval a řídil výzkumné programy v biologii telomer (konce chromozomů, které se během stárnutí zmenšují) a snahu o odvození lidské embryonální kmenové buňky. Carol Ezzell je spisovatelka a redaktorka.

VÍCE PROZKOUMAT:

Perspektivy využití jaderného přenosu při transplantaci člověka. Robert P. Lanza, Jose B. Cibelli a Michael D. West in NatureBiotechnology, sv. 17, č. 12, strany 11711174; Prosinec 1999.

Etická platnost použití jaderného přenosu v lidské transplantaci. Robert P. Lanza a kol. in Journal of the American Medical Association, Vol. 284, č. 24; 27. prosince 2000.

Debaty o výzkumu lidského embrya: bioetika ve víru kontroverze. Ronald M. Green. Oxford University Press, 2001.

Celý text našeho článku v e-biomed: The Journal of Regenerative Medicine je k dispozici na www.liebertpub.com/ebi