Porozumění vývoji a funkci pomocných T folikulárních buněk

Naivní aktivaci T-buněk a funkční diferenciaci vyvolává vrozený imunitní systém. V reakci na patogeny dendritické buňky (DC) upregulují kostimulační molekuly, aby pomohly připravit antigeny specifické T buňky. Kromě toho APC také vylučují více cytokinů, které regulují terminální diferenciaci T-buněk na efektorové T buňky. Nedávné studie stanovily kritické role pro kostimulační molekuly a určité cytokiny v diferenciaci Tfh buněk (obrázek 2).

Costimulation

Aktivace T-buněk je regulována kostimulačními molekulami. CD28, který je exprimován na naivních T buňkách, je nejdůležitějším kostimulačním receptorem podílejícím se na aktivaci T-buněk.28 Při absenci CD28 nebo jeho ligandů CD80 a CD86 bylo zjištěno, že diferenciace Th buněk do všech linií je významně snížena. Costimulace CD28 je také nezbytná pro vývoj Tfh buněk, takže myši s deficitem CD28 jsou spojeny s neúspěšnou upregulací CXCR5 a OX40 na T buňkách a narušením tvorby germinálního centra.17 Avšak reakce zprostředkované CD28, tvorba Tfh buněk a germinální tvorba centra se stává nezávislou na CD28 a závisí na ICOS, když je mutovaná Roquin E3 ubikvitinová ligáza.29

ICOS patří do rodiny CD28 a je exprimován na aktivovaných T buňkách. 30, 31, zatímco jeho ligand, B7h, je široce exprimován na APC v nelymfoidních tkáních. 32,33 Interakce ICOS-B7h je nezbytná pro optimální aktivaci T-buněk i pro určité efektorové funkce, jako je exprese IL-4 a IL-17. 34, 35, 36, 37, 38 Kromě toho hraje ICOS důležitou roli při regulaci protilátkových odpovědí závislých na T buňkách a reakcích germinálních center. Myši s nedostatkem ICOS nebo B7h vykazují zhoršenou tvorbu zárodečných center a přepínání izotypů. 34, 35, 36, 37, 39 V poslední době se také ukázalo, že tato kostimulační cesta je důležitá pro generování a udržování buněk CXCR5 + Tfh. Přesněji řečeno, myši s deficitem ICOS vykazovaly zhoršený vývoj buněk CXCR5 + Tfh v reakci na primární nebo sekundární imunizaci ovčími červenými krvinkami.6 Mezitím ablace B7h na APC vedla ke snížené expresi IL-21 T buňkami. Bylo také prokázáno, že ICOS je vysoce exprimován lidskými tonzilárními CXCR5 + T buňkami ve světelné zóně zárodečných center a účinně podporuje produkci imunoglobulinu. 40, 41 Navíc nedostatek ICOS u lidí a myší vedl k podstatně sníženému počtu Tfh buněk a hlubokým defektům Zrání B-buněk a přepínání izotypů imunoglobulinů, což ukazuje na zásadní roli ICOS v diferenciaci Tfh buněk.11,19 Je zajímavé, že mutace v ubikvitin ligase typu R3 E3 Roquin u myší vyvolala spontánní tvorbu germinálního centra a zvýšenou produkci autoprotilátek , což je spojeno s výrazně zvýšeným počtem Tfh buněk a zvýšenou expresí IL-21 a ICOS. 13

Protože B7h je kon stitutivně exprimované na B buňkách jsme zkoumali, zda generování Tfh buněk vyžaduje příbuznou interakci B – T-buněk.24 Analýza podmíněného knockout myší s nedostatkem exprese B-buněk B7h ukázala, že absence ICOS ligandu z B buněk vede k velmi snížená frekvence buněk Tfh. Kromě nižší exprese CXCR5 jsme zjistili, že exprese IL-21 v T buňkách byla u těchto myší výrazně snížena. Interakce ICOS-B7h tak může regulovat Tfh buňky produkcí IL-21. Také jsme pozorovali, že produkce antigenu specifického IgG a B-buňky arašídového aglutininu (PNA) + germinální centrum byly výrazně sníženy v nepřítomnosti exprese B7h na B buňkách. Naše data tedy naznačují, že exprese B7h na B buňkách je nezbytná pro generování buněk CXCR5 + Tfh, stejně jako pro produkci IL-21 a odpovídající protilátkové odpovědi, což naznačuje důležitou funkci in vivo pro B buňky při generování nebo udržování Tfh buněk .

Všechna výše uvedená pozorování naznačují, že defekty ve vývoji Tfh buněk a tvorbě germinálního centra u ICOS-deficientních myší a pacientů mohou být částečně způsobeny defektní produkcí IL-21, která obvykle působí jako autokrinní faktor, který rozšiřuje populaci buněk Tfh. Ve skutečnosti byl počet Tfh buněk snížen u myší s deficitem IL-21. Nedávná studie předložila důkazy o tom, že ICOS podporuje tvorbu Tfh buněk prostřednictvím upregulace exprese c-Maf, což zvyšuje expresi IL-21 v závislosti na dávce.42 Exprese c-Maf indukovaná ICOS tedy může podporovat tvorbu a udržování Tfh buněk prostřednictvím produkce autokrinního růstového faktoru IL-21.

SAP je exprimován v T buňkách a zprostředkovává odpovědi členům rodiny SLAM vazbou na konzervovanou doménu na těchto receptorech. Rodina receptorů SLAM se skládá ze sedmi členů: CD150 / SLAM, CD48 / SLAMF2, CD229 / Ly9 / SLAMF3, CD224 / 2B4 / SLAMF4, CD84 / SLAMF5, NTB-A / Ly108 / SLAMF6 a CD319 / CRACC / SLAMF7.Mutace SAP u lidí, stejně jako studie zahrnující myši s deficitem SAP, naznačují kritickou roli SAP v B-buněčné pomoci a přepínání tříd v Th buňkách.43 Za zmínku stojí, že SAP-deficientní T buňky vykazovaly zpožděnou a sníženou expresi ICOS, ale zvýšená a prodloužená exprese CD40L.44 SAP-deficientní CD4 + T buňky také nedokážou stabilně interagovat s příbuznými B buňkami, a proto nedokáží vyvolat klonální expanzi B-buněk.45 Tyto deficitní T buňky však stále exprimují normální hladiny CXCR5. SAP tedy hraje klíčovou roli při tvorbě zárodečných center zprostředkovaných Tfh buňkami po setkání s příbuznými B buňkami, místo aby reguloval migraci Tfh buněk.

CD84 / SLAMF5 a Ly108 / SLAMF6 jsou vysoce exprimovány v lidském těle a myší Tfh buňky.46, 47 Pomocí myší s nedostatkem CD84 prokázali Cannons et al., že CD84 je nezbytný pro tvorbu zárodečných center a diferenciaci Tfh buněk in vivo vlastním způsobem T buněk.47 Osa CD84-SAP je pravděpodobně kanonická cesta v CD4 + T buňkách, která zprostředkovává vývoj a funkci Tfh buněk.

Cytokiny

Cytokiny jsou hlavními regulátory diferenciace Th buněk. 1, 3 Th1 diferenciace je podporována IL -12 prostřednictvím aktivace STAT4. Cesta IFN-y-STAT1 zase udržuje vývoj buněk Th1, což vede k indukci transkripčního faktoru T-bet. Mezitím je IL-4 vylučován aktivovanými T buňkami a řídí polarizaci Th2 způsobem závislým na STAT6, což vede k aktivaci transkripčního faktoru GATA3 navíc IL-6 / IL-21 v kombinaci s TGF-p indukuje diferenciaci buněk Th17 prostřednictvím STAT3 závislé upregulace RORy. Tato diferenciace Tfh buněk zprostředkovaná cytokiny se však u myší a lidí liší.

IL-21

IL-21 hraje zásadní roli v regulaci produkce imunoglobulinu a tvorby zárodečných center. 12, 48 Tento cytokinový receptor patří do běžné rodiny y-řetězců, která také zahrnuje receptory pro IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 a IL-15. IL-21 signály přes STAT3 nebo STAT5a k regulaci funkcí různých typů buněk, jako jsou T buňky, B buňky, přirozené zabíječské buňky a DC, a je převážně exprimován CD4 + T buňkami a přirozenými zabíječskými T buňkami.49 Dříve se také uvádělo, že IL- 21 je ve vyšších hladinách exprimován Th2 než Th1 buňkami. 50 V druhém případě přidání IL-21 během diferenciace snižuje produkci IFN-y potlačením exprese Eomes.51 Rovněž bylo pozorováno, že IL-21 je indukován IL-6 prostřednictvím STAT3 a v kombinaci s TGF-β je nezbytný a dostatečný pro generování buněk Th17 prostřednictvím STAT3 závislé upregulace RO Rγ.52, 53, 54 Jak IL-21-, tak IL-21R-deficientní myši jsou defektní ve vývoji buněk Th17, což naznačuje, že IL-21 působí autokrinně, stejně jako IFN-y pro Thl buňky a IL-4 dělá pro Th2 buňky.

Navíc je vývoj u germinálních center narušen u myší s deficitem IL-21 a IL-21R.12 V této souvislosti jako vyšší producenti IL-21 než Th1, Th2 a podskupiny Th17, mají Tfh buňky příznivý dopad na změnu třídy protilátek a tvorbu germinálního centra. Dvě skupiny nedávno zdůraznily úlohu IL-21 při tvorbě Tfh buněk a B buněk zárodečných center. 24, 55 Imunizace IL-21-deficientních myší antigenem závislým na T-buňkách vedla k dramatickému snížení CD4 + CXCR5 + T buňky, což naznačuje, že IL-21 působí během vývoje Tfh buněk autokrinně.24 Kromě Tfh buněk byl u imunizovaných myší s nedostatkem IL-21 pozorován významně snížený počet B buněk zárodečného centra a snížená produkce IgG1. . Vogelzang a kol. prokázali, že těmito defekty byly spíše T-buňky než vnitřní B-buňky. 55

Ukázalo se, že IL-21 je indukován IL-6 způsobem závislým na STAT3. 24 Na rozdíl od Th17 generování Tfh buněk bylo nezávislé na TGF-β nebo na Th17 specifických osiřelých jaderných receptorech RORα a RORγ.24 Navíc jsme prokázali, že Th buňky produkující IL-21 mohou být generovány in vitro v přítomnosti IL-21, ale ne TGF-β, a že tyto buňky získávají profil exprese genu Tfh. 24 Přenos těchto in vitro generovaných buněk podobných Tfh produkujících IL-21 do naivních myší usnadnil funkci B buněk, podobně jako u Tfh buněk. Celkově tato zjištění potvrzují identitu Tfh buněk jako samostatnou Th linii a naznačují, že IL-21 je důležitý pro generování Tfh buněk a reakce zárodečných center u myší.

IL-12

Navzdory pokroku v charakterizaci mechanismů, které jsou základem vývoje myších Tfh buněk, zůstala vývojová regulace lidských Tfh buněk donedávna nejasná. Dvě nezávislé studie ukázaly, že IL-12 indukuje in vitro generaci lidských buněk podobných Tfh z naivních CD4 + T buněk.46, 56 Tfh buňky diferenciační pod vlivem IL-12 sdílejí klíčové rysy s Tfh buňkami nalezenými v periferních lymfoidních tkáních, včetně produkce IL-21, trvalé exprese ICOS a CXCR5 a schopnosti pomáhat diferenciaci B-buněk na imunoglobulin vylučující buňky. Je zajímavé, že expozice T-buněk na mandlí, pupečníkové krvi nebo dospělých periferních krvinek dospělým IL-12 (podmínky Th1) způsobila významné zvýšení exprese IL-21, zatímco sekrece IL-21 vyvolala IL-21, IL-6 a IL-23 v menší míře.46 Schmitt et al. prokázali, že IL-12 spouští vysoké hladiny produkce IL-21 prostřednictvím aktivace STAT4, zatímco IL-21 a IL-23 indukují nižší produkci IL-21 v lidských CD4 + T buňkách.56 Bylo také pozorováno, že IL-12 indukovaný IL- Buňky produkující 21 zahrnovaly podmnožiny IFN-γ + a IFN-γ-.

Není jasné, zda autokrinní aktivace IL-21 a STAT3 hraje nějakou roli v diferenciaci IL-21 indukovaného IL-21. -výroba Th buněk u lidí. Je zajímavé, že Ma et al. prokázali, že buňky IFN-γ + IL-21- a IFN-γ + IL-21 + exprimují vysoké hladiny T-bet, zatímco tvorba buněk IFN-γ + IL-21 + je vysoce závislá na expresi Bcl6.46 lidské naivní CD4 + T buňky kultivované v přítomnosti IL-12 exprimují vysoké hladiny CXCR5, což může být důležité pro lokalizaci těchto buněk do folikulů B-buněk. Kromě exprese CXCR5 léčba IL-12 také zvýšila hladiny exprese ICOS. Ještě důležitější je, že in vitro IL-12 aktivované, IL-21 sekretující buňky indukovaly významně více sekrece imunoglobulinu naivními B buňkami. Tento účinek byl závislý na signalizaci IL-21 a ICOS, ale nikoli na IFN-y. Lidské ICOS + CXCR5 + CD4 + T buňky generované in vitro v přítomnosti IL-12 tedy sdílejí fenotypové a funkční vlastnosti s Tfh buňkami. IL-21 a IL-12 jsou proto potřebné pro vývoj myších a lidských Tfh buněk.

IFN typu I

IFN typu I představují rodinu cytokinů s antivirovými a imunomodulační funkce.57 Mnoho podtypů IFN-α a jeden podtyp IFN-β jsou rychle indukovány v reakci na infekci a signálem prostřednictvím společného receptoru IFN-α.57 Bylo prokázáno, že tyto IFN účinně zvyšují primární protilátkovou odpověď na proteinový antigen, zvyšující produkci všech podtříd IgG.58, 59 Kromě toho IFN typu I podporovaly protilátkové odpovědi, když byly DC divokého typu přeneseny na myši s deficitem IFN-α receptoru, což poskytuje přímý důkaz, že stimulace DC typu I-IFN zvýšit imunitní odpověď in vivo.58, 59

Nedávná studie odhalila, že signalizace typu I-IFN v DC selektivně stimuluje vývoj buněk Tfh v reakci na antigen vázaný na agonisty 3 nebo 4 Toll-like receptoru.60 Kromě toho je pro in vivo Tfh nutná DC produkce IL-6 generování buněk a zrání afinity protilátek. IFN typu I tedy zvyšují protilátkové odpovědi závislé na T buňkách tím, že slouží jako přírodní adjuvans pro generování CXCR5 + Tfh buněk rezidentních v lymfatických uzlinách. Zbývá určit, jaká podskupina DC reguluje generování Tfh buněk.

Pacienti se systémovým lupus erythematodes (SLE) zvýšili hladiny IFN-α, což koreluje se závažností onemocnění.61 Kromě toho studie v různých myší kmeny náchylné k lupusu odhalily kritickou roli IFN typu I v patologii podobné lupusu.62, 63, 64 Zvýšený počet Tfh buněk byl také pozorován u myších modelů SLE, 6, 65, kde jsou pro lupus vyžadovány patologie podobná.66 Generování Tfh buněk závislých na IFN typu I během autoimunitní odpovědi však dosud nebylo řešeno a vyžaduje další zkoumání.

Transkripční faktory

Diferenciace naivních CD4 + T buňky do různých linií se stanoví cytokinovou signalizací a následnou aktivací specifických transkripčních faktorů (obrázek 1). Například signalizace IFN-y / IL-12 prostřednictvím STAT1 / STAT4 reguluje transkripci T-bet v buňkách Th1, 67 zatímco signalizace IL-4 prostřednictvím STAT6 aktivuje expresi GATA3 v buňkách Th2. 68 IL-6 i IL-21 působí prostřednictvím STAT3, což vede k upregulaci exprese dvou Th17-specifických osiřelých jaderných receptorů RORγ a RORα, které nakonec určují terminální diferenciaci buněk Th17.3 U diferenciace buněk Tfh bylo prokázáno, že ani Th1-specifická (STAT4, T-bet ) ani transkripční faktory selektivní pro Th2 (STAT6, GATA3) .24 Navzdory skutečnosti, že linie Th17 i Tfh vyžadují IL-6 / IL-21 a STAT3, vývoj buněk Tfh nevyžaduje transkripční faktory související s Th17 (RORα a RORγ). Spíše je Bcl6 hlavním transkripčním regulátorem diferenciace Tfh buněk.

STAT3

Bylo hlášeno, že IL-21 je nezbytný pro diferenciaci Tfh buněk24 a je indukován v T buňkách IL- 6 způsobem závislým na STAT3. 52 K určení, zda je pro vývoj Tfh buněk vyžadována signalizace STAT3, Nurieva et al. analyzovala generování Tfh buněk u myší Stat3f / f zkřížených s CD4-cre myší.Imunizace těchto myší hemocyaninem s klíčovou dírkou v úplném Freundově adjuvans odhalila velké snížení CXCR5 + Tfh buněk v nepřítomnosti STAT3. Navíc nedostatek STAT3 v T buňkách vedl k defektní generaci B-buněk germinálního centra a snížené produkci IgG a IgM specifické pro hemokyanin specifické pro klíčovou dírku. STAT3 tedy hraje důležitou roli v diferenciaci buněk Tfh.

Bcl6

Transkripční faktor Bcl6 je selektivně exprimován myšími a lidskými Tfh buňkami. 69, 70 Bylo dříve prokázáno, že inhibuje Th2 reakce blokováním vazby STAT6 na DNA, 71, 72, zatímco myši s deficitem Bcl6 vykazují multiorgánová zánětlivá onemocnění, zvýšenou produkci IgE a defektní reakce germinálního centra. 71, 73 Nicméně nebylo jasné, zda porucha germinálního centra u těchto myší byla způsobena nedostatkem správné funkce T- a / nebo B-buněk, protože B buňky v germinálním centru také exprimují Bcl6.74 Nedávno naše skupina a další ukázali, že transkripční faktor Bcl6 je mistr r egulátor diferenciace Tfh buněk. 25, 26, 27

Exprese Bcl6 je indukována IL-6 a IL-21 a nadměrná exprese Bcl6 podporuje vývoj Tfh buněk v nepřítomnosti exogenních cytokinů. 25 Nadměrná exprese Bcl6 také vede ke zvýšené expresi endogenní Bcl6 mRNA, jakož i IL-21R, IL-6R a CXCR5 mRNA, jak je tomu v buňkách ošetřených IL-6 nebo IL-21. Je zajímavé, že exprese IL-21 nebyla nadregulována nadměrnou expresí Bcl6. Exprese Bcl6 také nebyla nutná pro vývoj buněk Th1, Th2 nebo Th17 a nadměrná exprese Bcl6 ve skutečnosti potlačovala produkci cytokinů Th1, Th2 a Th17.25

Funkce Bcl6 se zdá být závislá na DNA vazba.25, 26 Váže se na promotory transkripčních regulátorů T-bet a RORγt, které určují osud buněk Th1 a Th17, což vede k represi produkce IFN-y a IL-17.26 Dále Bcl6 potlačuje exprese mikroRNA, o kterých se předpokládá, že inhibují podpis Tfh buněk, včetně miR-17-92, který potlačuje expresi CXCR5. Bcl6 tedy reguluje vývoj Tfh buněk prostřednictvím potlačení transkripčních faktorů specifických pro Th1, Th2- a Th17. Nedostatek Bcl6 v T buňkách vedl k narušení vývoje Tfh buněk jak in vitro, tak in vivo a nedostatek obou B a T buněk je nutný pro reakce zárodečných center. 25, 26, 28

Dohromady, tyto výsledky ukazují, že Bcl6 je jak nezbytný, tak dostatečný pro vývoj Tfh buněk a poskytuje další důkazy podporující myšlenku, že Tfh buňky jsou odlišnou linií Th buněk.

c-Maf

c- Maf byl první identifikovaný transkripční faktor, který byl přednostně exprimován v buňkách Th2. 75 Váže se na proximální promotor IL-475 a slouží jako faktor specifický pro Th2. T buňky deficitní v c-Maf byly narušeny v expresi IL-4 během efektorové fáze, zatímco exprese dalších Th2 cytokinů byla buď mírně snížena, nebo nebyla ovlivněna.76 Dong, et al., Dříve s použitím myší s deficitem ICOS a B7h. popsané mechanismy, kterými ICOS zprostředkovává produkci IL-4 regulací exprese c-Maf v efektorových Th buňkách. 36, 77 V těchto liniích je fenotyp myší s C-Maf knockoutem podobný fenotypu myší s nedostatkem ICOS. Nadměrná exprese c-Maf navíc obnovuje uvolňování IL-4 T buňkami aktivovanými v nepřítomnosti interakce ICOS-B7h. Kromě defektní produkce IL-4 jsou myši s deficitem ICOS a B7h narušeny při generování Tfh buněk a produkci IL-21. 24 Kuchroo et al. nedávno prokázalo, že Tfh buňky se vyznačují vysokou expresí c-Maf a že c-Maf zvyšoval hladiny IL-21 způsobem závislým na dávce.42 Mezitím delece c-Maf vedla ke sníženému počtu Tfh exprimujících IL-21 ICOS tedy reguluje diferenciaci Tfh buněk produkujících IL-21 prostřednictvím upregulace exprese c-Maf.

IFN regulační faktor 4 (IRF4)

IRF4 byl původně popsán jako transkripční faktor specifický pro Th2, 78, 79 částečně, protože myši s deficitem IRF4 vykazují významně snížené hladiny sérového imunoglobulinu.80 Nedávné studie však ukázaly, že tento transkripční faktor je indukován signalizací IL-1 a je nezbytný pro diferenciaci buněk Th17 0,81, 82 IRF4-deficientních T buněk naopak neindukuje linii Th17 po stimulaci IL-21 a TGF-p. 83 Kromě toho T buňky bez proteinu vázajícího IRF4, přirozeného antagonisty IRF4, vykazují zvýšené Produkce IL-21. 84 IRF4 je tedy rozhodující pro produkci IL-21 i pro IL-2 1 zprostředkovaná diferenciace Th buněk.

Na základě těchto zjištění se zdá, že IRF4 může také hrát roli v diferenciaci Tfh buněk. Ve skutečnosti IRF4-deficientní myši generují po imunizaci méně CXCR5 + ICOS + Tfh buněk, což ukazuje na důležitost IRF4 během diferenciace Tfh buněk in vivo. Zbývá určit, zda je tvorba Tfh buněk závislá na IRF4 vnitřní T-buňkou a zda IRF4 reguluje během vývoje Tfh linie maturační protein-1 (Blimp-1) indukovaný Bcl6 a B lymfocyty.

Negativní regulace

Diferenciace Tfh buněk je regulována programem, který antagonizuje vývoj dalších linií Th potlačením transkripčních faktorů specifických pro danou linii (T-bet, GATA3 a RORγ). Nebylo však hlášeno, zda tyto faktory také negativně regulují diferenciaci Tfh buněk. Blimp-1, který byl dříve popsán jako antagonizující Bcl6 v B buňkách, 86 je významně snížen v Tfh buňkách ve srovnání s non-Tfh CD4 + T buňkami. 27 Nadměrná exprese Blimp-1 v CD4 + T buňkách tedy brání expresi Bcl6 a významně snižuje diferenciace Tfh buněk bez ovlivnění vývoje Th2-, Th17- a Treg buněk. Navíc Blimp-1-deficientní CD4 + T buňky vykazovaly zvýšenou diferenciaci do Tfh linie.27